TESIS

INDICE

2.1 Criterios convencionales de identificación humana.

2.2 La identificación de individuos por técnicas bioquímicas que evalúan el fenotipo.

2.3 La identificación de individuos por técnicas bioquímicas que evalúan el genotipo: los análisis de ADN.

2.4 Objetivos.

3 MATERIALES

3.1 Fluídos corporales

3.2 Pelos

3.3 Uñas

3.4 Restos humanos

3.5 Reactivos

4 METODOS

4.1 Procedimientos de extracción de ADN

4.2 Purificación del ADN aislado

4.3 Cuantificación del ADN purificado

4.4 Análisis de ADN de alto peso molecular

4.5 Análisis de ADN en condiciones variables de degradación: los métodos de PCR.

4.6 Desarrollo de nuevos sistemas de aplicación forense

5 RESULTADOS

5.1 Fluídos corporales

5.2 Análisis de pelos

5.3 Análisis de uñas

5.4 Restos humanos

5.5 Desarrollo de nuevos sistemas de aplicación forense

6.1 Extracción y análisis de ADN de fluídos corporales

6.2 Análisis de pelos

6.3 Análisis de uñas

6.4 Análisis de restos humanos

6.5 Desarrollo de nuevos sistemas de aplicación forense

8 BIBLIOGRAFIA

1 RESUMEN

A mediados de los ´80 comienzan a desarrollarse sistemas de identificación de individuos basados en el estudio de polimorfismos de ADN, los cuales reflejan la amplia variación de secuencias localizadas en diferentes regiones del genoma.

La variabilidad de estas zonas radica en diferencias exhibidas por el material genético, en la secuencia nucleotídica misma a través de sustituciones de nucleótidos, o en la distinta longitud generada por una misma secuencia que se repite un número diferente de veces, como fuera demostrado por primera vez por Wyman and White (1980). Comenzaron a ser estudiadas cuando fué posible conocer su localización y desarrollar una metodología adecuada para ponerlas de manifiesto, mediante sistemas de análisis cada vez más precisos y sencillos.

Los primeros trabajos, publicados a mediados de los ´80, empleaban fragmentos de ADN obtenidos por digestión con enzimas, separados electroforéticamente y transferidos a un soporte sólido, el cual se trataba con una "sonda" constituída por secuencias complementarias de las regiones variables, marcada radiactivamente. Por autorradiografía, resultaba posible observar varias bandas, de localización desconocida dentro del genoma, pero que eran características de cada individuo y se heredaban de padres a hijos (Jeffreys et al, 1985a y b).

Si bien las bandas producidas por estas sondas multilocus eran muy variables de una persona a otra, los resultados eran difícilmente reproducibles, ya que pequeñas y poco controlables diferencias en la corrida electroforética (voltaje, tiempo, concentración del gel) afectaban en gran medida la reproducibilidad e interpretación de los resultados.

El descubrimiento de regiones hipervariables del genoma con localización específica (Nakamura et al, 1987) permitió el desarrollo de las sondas de locus único que resolverían el problema, posibilitando el estudio de una zona conocida del genoma que se visualizaba como dos únicas bandas para la condición heterocigota, correspondientes cada una a un alelo, heredado de cada progenitor.

Estas zonas están constituídas por secuencias repetidas, que aparentemente carecen de función como codificantes de proteínas. La menor variabilidad exhibida por estos sistemas de análisis se solucionaba empleando un conjunto de cuatro o más sondas unilocus que evaluaban otras tantas regiones del genoma.

Sin embargo, aún persistía un inconveniente para el empleo masivo de estas metodologías en la práctica forense: las sondas multilocus, y en menor medida las unilocus, requerían un ADN en estado óptimo en cuanto a su integridad, de alto peso molecular, lo cual rara vez ocurre en cadáveres en proceso de descomposición, o en manchas antiguas de fluídos biológicos o expuestas a condiciones ambientales adversas.

La solución llegó con el desarrollo de técnicas de amplificación o "copiado" de porciones de ADN mediante la "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", con las cuales fue posible implementar sistemas de análisis de secuencias más pequeñas ("microsatélites" o "STRs"), pero menos variables que las anteriores. Con el advenimiento de esta nueva técnica, se hizo posible la evaluación de polimorfismos en cuanto a la secuencia nucleotídica de la región variable, además de las diferencias de longitud.

La permanente innovación metodológica exige la actualización y perfeccionamiento de los sistemas validados por la comunidad forense internacional, que cuenta al presente con la posibilidad de evaluar un centenar de regiones variables del genoma.

En una primera etapa, el presente trabajo consistió en el perfeccionamiento de las técnicas de extracción y purificación de ADN a partir de fluídos biológicos y sus manchas obtenidas experimentalmente, estudiándose la influencia del soporte y de la presencia de mezclas.

Posteriormente, se analizaron manchas e hisopados provenientes de casos judiciales que contenían semen y fluídos no seminales, evaluándose la eficiencia de los métodos de purificación, de las condiciones de conservación y del soporte, correlacionando los resultados con los obtenidos previamente.

En una segunda etapa, se estudiaron pelos, uñas y material cadavérico en condiciones de conservación variable, proveniente de individuos de diferente edad y sexo, a efectos de determinar los métodos de extracción de ADN más eficientes y las condiciones de conservación más adecuadas de las muestras.

El estudio de tejidos humanos provenientes de desastres en masa (atentado a la Embajada de Israel y a la mutual israelita AMIA, entre otros), permitió diseñar nuevos métodos de análisis rápido y evaluar la eficiencia de los sistemas conocidos.

Finalmente, la identificación de secuencias ubicadas en el cromosoma Y humano y su distribución intra e interpoblacional, encarada en la Argentina por nuestro grupo como parte de un estudio a nivel mundial, constituyó un importante aporte a las ciencias forenses y antropológicas.

Estos sistemas, optimizados para su análisis en reacciones "multiplex", se emplean actualmente en casos de paternidad discutida sobre un hijo varón, cuando el supuesto padre no se encuentra disponible o se niega al estudio, analizándose cualquier hombre perteneciente a la misma patrilínea que el progenitor ausente: la coincidencia de las secuencias variables del cromosoma Y será total, de existir el vínculo biológico.

Resultan además de gran utilidad en el estudio de evidencias provenientes de delitos sexuales, donde puede establecerse el patrón genético del emisor del semen sin la habitual contaminación con el ADN de la víctima.

Este trabajo constituye un modesto aporte científico a la resolución de necesidades sociales encuadradas en el ámbito de la Justicia Civil y Criminal.

En su conjunto, el desarrollo de nuevas metodologías de análisis que hacen posible la identificación de individuos, restos humanos y rastros biológicos, constituye una nueva y valiosa herramienta forense.

2 INTRODUCCION

1.1 CRITERIOS CONVENCIONALES DE IDENTIFICACION HUMANA

La identificación de individuos

Una de las acepciones de la palabra "Identificar" es "reconocer si una persona es la que se busca". Es decir, se trata de establecer su individualidad determinando aquellos rasgos o conjunto de cualidades que la distinguen de todos los demás y hacen que sea ella misma.

Las cuestiones relacionadas con la identificación de las personas tienen una enorme importancia en Medicina Legal, tanto en el caso de sujetos vivos como de cadáveres.

Conceptos aplicados a personas vivas.

En la identificación de delincuentes, enfermos mentales con amnesia, menores sin documentos, etc., resultan de utilidad las siguientes observaciones, siempre y cuando se cuente con archivos o datos suministrados por otras personas:

Exámenes generales

* Datos fisonómicos: la descripción de los rasgos fisonómicos constituye el medio más simple para la identificación, al que recurrimos en nuestra vida diaria: reconocemos visualmente a las personas cuyas facciones hemos registrado previamente en nuestra memoria.

Existe además una "memoria institucional", como la que poseen el Registro Civil y la Policía, que consiste en un archivo de fotografías de las personas en "documentos de identidad".

* Sexo: su determinación no ofrece dificultades, excepto en casos complejos de hermafroditismo.

* Peso, talla y edad estimadas.

* Sistema piloso: color, tipo y forma de implantación del cabello, o su ausencia.

* Color de ojos y piel.

* Marcas particulares: cicatrices, defectos congénitos, tatuajes y estigmas profesionales.

Huellas dactilares:

Son las impresiones que dejan los pulpejos de los dedos manchados con tinta, sudor u otros líquidos, sobre una superficie pulimentada, constituídos por surcos y crestas que dan lugar a figuras siempre diferentes, gracias a lo cual permiten la identificación de las personas.

Las huellas dactilares se prestan a una clasificación coherente y a su ordenación en archivos de sencilla localización (Galton, 1892; Henry, 1900; Jiménez Jerez, 1913). No se han hallado dos personas en las que sean idénticas, ni aún en los gemelos univitelinos.

Registro de la voz:

La frecuencia y amplitud de las vibraciones de las cuerdas vocales resultan propias e idénticas para cada persona, incluso si se intenta disimular la voz (Kersta, 1962).

Por otra parte, mediante la aplicación de métodos lingüísticos analíticos, es posible obtener indicios sobre la edad, sexo, nivel cultural, ocupación y antecedentes geográficos y étnicos del hablante ("Manual de Ciencias Forenses", FBI).

Trazado caligráfico:

La firma y el trazado caligráfico presentan características propias del ejecutor, que pueden conducir a su identificación comparándolos con los obrantes en archivos o escritos indubitados (Del Picchia, 1993).

Guzmán (1994) afirma que "del mismo modo que no hay dos seres humanos idénticos, tampoco hay dos escrituras idénticas: las peculiaridades físicas y mentales de cada individuo originan personalidades gráficas indiscutiblemente únicas y diferentes unas de otras".

En tal sentido, debe tenerse en cuenta que para la confección de un escrito existen, además de impulsos cerebrales inconscientes, mecanismos motrices muy automatizados que, si bien soportan cambios graduales en el curso de la vida, no hacen perder los elementos básicos de la escritura.

Huellas genéticas:

Desde mediados de la década pasada, el estudio de regiones hipervariables presentes en el genoma humano resulta de gran utilidad en la identificación de individuos, a partir de un registro previo o bien de sus familiares biológicos.

Dado que estas secuencias son heredables, permiten además efectuar estudios de paternidad, a diferencia de los sistemas identificatorios previamente mencionados.

Identificación de cadáveres

Cuando se trata de cadáveres recientes, se aplican las mismas observaciones que para individuos vivos, con la obvia exclusión del registro de voz y trazado caligráfico. Con el transcurso del tiempo, se producen una serie de modificaciones que dificultan la identificación.

Las modificaciones post-mortem

Desde el mismo momento de la muerte, comienzan a producirse cambios físicos y químicos, que deben tenerse en cuenta a los efectos de la identificación individual.

Gisbert Calabuig (1991) los clasifica de acuerdo con el efecto más o menos deletéreo sobre el tejido cadavérico en procesos "destructores" o "conservadores".

Procesos destructores del cadáver

* Autólisis:

Es el conjunto de procesos fermentativos anaeróbicos que ocurren en el interior de la célula por la acción de las propias enzimas celulares, sin intervención bacteriana (Laiho and Pentilla, 1981). La necrosis se produce por la liberación al citoplasma de las enzimas contenidas en los lisosomas.

Es el más precoz de los procesos transformativos cadavéricos, siendo sucedido por la putrefacción. A menudo, los fenómenos autolíticos y putrefactivos se superponen en su evolución.

* Putrefacción:

Consiste en un proceso de fermentación pútrida de origen bacteriano (Evans, 1963). Los gérmenes producen enzimas que actúan selectivamente sobre proteínas, grasas e hidratos de carbono, dando lugar a modificaciones profundas del cadáver que conducen a su destrucción.

Una vez terminado este proceso, sólo persisten las partes esqueléticas de naturaleza calcárea, los dientes, las uñas y los pelos, mientras que las partes blandas se reintegran al ciclo biosférico.

La putrefacción evoluciona en cuatro fases o períodos:

I- Período colorativo o cromático: se produce una mancha verde en la fosa ilíaca derecha, que después se extiende a todo el cuerpo. Se va oscureciendo progresivamente hasta asumir un tono pardo negruzco, a veces con un matiz rojizo por la hemólisis concomitante.

Este período se inicia 24 horas después de la muerte y dura varios días.

II- Período enfisematoso o de desarrollo gaseoso: Se producen gases que desfiguran todas las partes del cadáver: se hinchan visiblemente el tórax, el abdomen y la cabeza, los ojos presentan exorbitismo y la lengua se proyecta al exterior de la boca.

Se origina una circulación sanguínea post-mortem por la contracción del ventrículo izquierdo y por la presión de los gases putrefactivos, permitiendo la observación de la red vascular superficial.

Este período dura entre varios días y un par de semanas.

III- Fase colicuativa: La epidermis se despega de la dermis, formándose ampollas llenas de líquido. Los gases se van escapando y el cuerpo pierde el aspecto "hinchado" característico de la fase anterior.

Este período dura de 8 a 10 meses.

IV- Reducción esquelética: Paulatinamente, a lo largo de 2 a 5 años, todas las partes blandas del cadáver irán desapareciendo. Los elementos más resistentes suelen ser el fibroso, ligamentos y cartílagos, por lo cual el esqueleto permanece unido durante todo este período, aunque al final también llegan a destruírse estos elementos.

Procesos conservadores del cadáver

a - NATURALES

* Momificación: Consiste en la desecación del cadáver por evaporación del agua de sus tejidos, manteniendo sus formas exteriores de un modo notablemente prolongado. El hecho esencial de este proceso radica en la rápida desecación del cuerpo, que al privarle de agua hace imposible el desarrollo de los gérmenes, por lo cual detiene e impide la putrefacción ordinaria (Franchini, 1939).

Las circunstancias ambientales favorecedoras de la momificación son: sequedad, calor y aire circulante con facilidad y abundancia. Entre las condiciones individuales merecen citarse la delgadez y la corta edad, por ser en ellos más sencillos los procesos de deshidratación cadavérica.

* Saponificación: es un proceso transformativo que conduce a la formación de una coraza grasa, untuosa y viscosa en estado húmedo, pero que después de haberse secado al aire adquiere consistencia dura, granulosa, de color gris blanquecino (Hausman et al, 1970). Debido a que la sustancia poseía propiedades intermedias entre la grasa y la cera, originalmente se le dió el nombre de adipocira.

Desde el punto de vista ambiental, favorecen la saponificación la humedad y el obstáculo al acceso de aire, mientras que desde el punto de vista individual lo primordial es la existencia más o menos abundante de grasa en el cadáver.

* Corificación: consiste en un embalsamamiento natural, que sólo tiene lugar en cadáveres conservados en ambientes herméticos. La piel adquiere el aspecto y la consistencia del cuero recién curtido, por una marcada desecación de todos los tejidos, con mantenimiento notable de las formas.

* Congelación: el frío intenso y prolongado permite la conservación del cadáver en forma prácticamente indefinida. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que una vez producida la descongelación se aceleran los procesos destructores del cadáver.

b - ARTIFICIALES

* Conservación transitoria: Se logra mediante inyección o sumersión en formol y/o con sustancias antisépticas como el sulfato de cinc.

* Embalsamamiento: Consiste en una inyección intraarterial generalizada de un líquido fijador y conservador a base de formol, el cual realiza simultáneamente el drenaje de la sangre venosa, complementada con el tratamiento de las grandes cavidades por la introducción del mismo u otro líquido conservador. Se completa con un conjunto de maniobras estéticas sobre las partes que permanecerán visibles dentro del féretro (Lecha-Marzo, 1924).

* Refrigeración: Se realiza en cámaras especiales, que mantienen la temperatura alrededor de 4 grados centígrados, con el objeto de retardar los procesos destructores del cadáver con fines forenses o de estudio.

Cómo se identifica un cadáver ?

Ante el hallazgo de restos cadavéricos o huesos aislados, se plantean en la práctica forense varios interrogantes, que se tratan de resolver en forma sucesiva: datación de los restos, diagnóstico de especie y diagnóstico individual.

Datación de los restos:

Se trata de establecer cuándo ocurrió la muerte del sujeto, en base a diferentes criterios (Castellano et al, 1984):

* Morfológicos: se estudian las modificaciones post-mortem, que varían en función del tiempo de muerte, de acuerdo a lo reseñado en el capítulo anterior.

* Químicos: los huesos antiguos sufren cambios químicos, con degradación putrefactiva gradual de la parte orgánica y enriquecimiento en minerales, que a su vez se intercambian con los del suelo en que se encuentran en contacto.

* Biológicos: se estudia la fauna cadavérica, que varía notablemente con el tiempo.

Diagnóstico de especie:

No ofrece dificultad cuando el esqueleto está completo, dadas las notables diferencias anatómicas entre las distintas especies animales (Aznar y Maestre, 1945). Caso contrario, se recomiendan métodos inmunológicos, basados en reacciones antígeno-anticuerpo (Schleyer, 1962), ó análisis de ADN, ya que casi todas las regiones variables estudiadas en la práctica forense son específicas de material biológico humano.

Diagnóstico individual:

Datos genéricos

Permiten situar los restos dentro de un grupo más o menos amplio de individuos, estableciendo características étnicas, sexo, edad y talla aproximada (Azevedo Neves, 1949; Eliakis et Iordanidis, 1963a,b, 1966).

* Características étnicas: consiste en el estudio antropológico del cráneo, de los índices cefálicos, facial superior, nasal y prognatismo.

* Sexo: es posible morfológicamente cuando se dispone de pelvis, cráneo y/o fémures. Caso contrario, debe analizarse el ADN estudiando secuencias características de los cromosomas X e Y.

* Edad: el sistema óseo experimenta transformaciones muy marcadas en los períodos extremos de la vida, infancia y senectud, pero paulatinos y poco evidentes en las edades intermedias, lo cual limita la exactitud de esta determinación.

* Talla: existe una correlación muy definida entre la talla y la longitud de los huesos largos, que permite un cálculo bastante aproximado. Cuando sólo se cuenta con otros huesos, se emplean tablas de conversión basadas en la proporcionalidad existente entre los distintos segmentos del cuerpo.

Datos individualizadores:

* Elementos extrínsecos al cadáver: se analizan aquellos objetos que resisten el paso del tiempo sin destruírse, como cinturones, medallas, anillos o relojes.

* Caracteres patológicos, naturales o traumáticos que afecten el esqueleto.

* Identidad radiográfica: varios autores han propuesto la medición de parámetros radiográficos con fines de identificación individual (Asherson, 1965; Calicó, 1933; Clavelin et Dérobert, 1946), actualmente casi en desuso.

Mayor interés tiene el método desarrollado por Glaister (1945), que consiste en superponer una radiografía del cráneo y cara con una fotografía de la supuesta víctima, ambas a la misma ampliación. Gill et al (1993) realizaron con éxito la superposición en la identificación de miembros de la familia real rusa, asesinados en 1917.

* Identificación dental: los dientes son las piezas más resistentes del cuerpo a la destrucción tanto física como química. Un estudio detallado permite conocer especie, raza, sexo, talla y edad aproximadas, además de valiosos datos sobre identificación individual (Clement and Sri-Skanda, 1985; Seigal et al, 1975). En este último caso, es imprescindible contar con información dental previa de la supuesta víctima .

Las fuentes de variabilidad en los dientes pueden ser de naturaleza congénita, como la forma y el tamaño; estigmas debidos a profesiones o hábitos, como el color característico en los fumadores; enfermedades graves de la infancia que afectan la formación de la dentina y el esmalte; y la existencia de tratamientos odontológicos.

* Métodos bioquímicos: los análisis que evalúan el fenotipo, como los grupos sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, proteínas plasmáticas y enzimas eritrocitarias no suelen ser útiles en la identificación de cadáveres, ya que se alteran rápidamente luego de la muerte.

A partir de mediados de los '80, la detección y el aislamiento de secuencias hipervariables presentes en el genoma humano revolucionaron los criterios de identificación de individuos. La posibilidad de identificar a un sujeto empleando pequeñas muestras de fluídos corporales, como manchas de sangre o semen; o de tejidos, como pequeños fragmentos de piel o bulbos pilosos, ha ampliado, en gran medida, el espectro metodológico de la Bioquímica Forense.

Las variabilidad de estas zonas del genoma radica en diferencias exhibidas por el material genético: el ácido desoxirribonucleico (ADN), que pueden reflejarse sea en la secuencia nucleotídica misma a través de sustituciones de nucleótidos, o en la distinta longitud generada por una misma secuencia que se repite un número diferente de veces, como fuera demostrado por primera vez por Wyman and White (1980). Comenzaron a ser estudiadas cuando fué posible conocer su localización y/o desarrollar una metodología adecuada para ponerlas de manifiesto, mediante sistemas de análisis cada vez más precisos y sencillos.

Los primeros trabajos, publicados a mediados de los '80, empleaban fragmentos de ADN obtenidos por digestión con enzimas, separados electroforéticamente y transferidos a un soporte sólido, el cual se trataba con una "sonda" constituída por secuencias complementarias de las regiones variables, marcada radiactivamente. Por autorradiografía, resultaba posible observar varias bandas, de localización desconocida dentro del genoma, pero que eran características de cada individuo y se heredaban de padres a hijos (Jeffreys, 1985).

Si bien las bandas producidas por estas sondas multilocus eran muy variables de una persona a otra, los resultados eran difícilmente reproducibles, ya que pequeñas y poco controlables diferencias en la corrida electroforética (voltaje, tiempo, concentración del gel) afectaban en gran medida la la reproducibilidad e interpretación de los resultados.

El descubrimiento de regiones hipervariables del genoma con localización específica permitieron el desarrollo de las sondas de locus único (Nakamura et al.1987) resolvería el problema, permitiendo el estudio de una zona conocida del genoma, que se visualizaba como dos únicas bandas para la condición heterocigota, correspondientes cada una a un alelo.

Estas zonas están constituídas por secuencias repetidas, que aparentemente carecen de función como codificantes de polipéptidos. La menor variabilidad exhibida por estos sistemas de análisis se solucionaba empleando un conjunto de cuatro o más sondas unilocus.

Sin embargo, aún persistía un inconveniente para el empleo masivo de estas metodologías en la práctica forense: las sondas multilocus, y en menor medida las unilocus, requerían un ADN en estado óptimo en cuanto a su integridad, de alto peso molecular, lo cual rara vez ocurre en cadáveres en proceso de descomposición, o en manchas antiguas de fluídos biológicos o expuestas a condiciones ambientales adversas.

La solución llegó con el desarrollo de técnicas de amplificación de porciones de ADN mediante la "reacción en cadena de la polimerasa" o PCR, con las cuales fué posible implementar sistemas de análisis de secuencias más pequeñas ("microsatélites"), pero menos variables que las anteriores. Con el advenimiento de esta nueva técnica, se hizo posible la evaluación de polimorfismos en cuanto a la secuencia nucleotídica de la región variable, además de las diferencias de longitud.

Actualmente, la posibilidad de analizar un gran número de ellas permite realizar estudios certeros a partir de material biológico degradado en forma severa.

2.2 LA IDENTIFICACION DE INDIVIDUOS POR TECNICAS BIOQUIMICAS QUE EVALUAN EL FENOTIPO.

Las técnicas bioquímicas de identificación de individuos, previas al conocimiento actual del ADN, se basaban en la comparación de productos de expresión de diferentes genes. Estas proteínas, como los antígenos eritrocitarios (grupos sanguíneos), enzimas eritrocitarias, proteínas plasmáticas y antígenos de histocompatibilidad (HLA), son marcadores que se transmiten obedeciendo a las leyes mendelianas de la herencia:

Grupos sanguíneos:

Sus antígenos se hallan en la superficie de los glóbulos rojos, y sus correspondientes anticuerpos forman parte de las inmunoglobulinas del plasma.

Los antígenos del sistema ABO se hallan también en otras células y en fluídos corporales (saliva, orina, semen, leche) en individuos secretores. Al sistema ABO, descubierto en 1901 por Landsteiner, se fueron agregando posteriormente otros, como el RH, MNS, Duffy, Lewis, Kidd, Lutheran, etc. En conjunto, presentan un rango de probabilidad de exclusión (es decir, de excluir la paternidad biológica de padres falsamente alegados), de alrededor del 75 %.

Proteínas plasmáticas:

Las más frecuentemente utilizadas como marcadores genéticos en las pruebas de filiación son la haptoglobina, alfa-1- antitripsina, transferrina, proteínas grupo específicas Gc, orosomucoide, factor B del sistema properdina, fracción C3 del complemento, alotipos Gm y Km, de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulinas. Su rango de probabilidad de exclusión es de alrededor de 71 %.

Enzimas eritrocitarias:

Las que presentan mayor polimorfismo son la fosfatasa ácida eritrocitaria (EAP), adenilato kinasa (AK), transaminasa glutámico-pirúvica (GPT), fosfoglucomutasa (PGM), esterasa D (EsD), adenosín deaminasa (ADA), fosfogluconato dehidrogenasa (PGD) y glioxalasa (GLO). El rango de probabilidad de exclusión oscila en el 61 %.

Antígenos de histocompatibilidad (HLA):

Están codificados por los genes del Complejo Mayor de Histocompatibilidad, ubicados en los loci A, B, C, D, DR, DQ y DP del brazo corto del cromosoma 6.

Los antígenos HLA-A, B y C están presentes en todas las células nucleadas del organismo; en cambio los HLA-D y R se distribuyen en forma más limitada: sobre linfocitos B, macrófagos, espermatozoides, células de Langerhans, etc.. Presentan en su conjunto un rango de probabilidad de exclusión de aproximadamente 95 %.

Las pruebas de HLA en estudios de paternidad comenzaron a ser aceptadas en las Cortes a partir de principios de los '70, aunque su origen científico se sitúa unos 15 años antes por su utilidad en otra área de la identificación humana: la determinación de la compatibilidad entre dador y receptor de un transplante de órganos.

2.3 LA IDENTIFICACION DE INDIVIDUOS POR TECNICAS BIOQUIMICAS QUE EVALUAN EL GENOTIPO: LOS ANALISIS DE ADN.

ESTRUCTURA Y FUNCION DEL ADN

En los organismos vivos, la información hereditaria es almacenada en el ácido desoxirribonucleico (ADN), constituyendo éste el material genético primordial, a excepción de algunos virus que almacenan su información genética en el ácido ribonucleico (ARN).

El ADN fué descubierto por Miescher en 1871, pero recién se lo identificó como portador de la información genética a mediados de nuestro siglo (Avery et al, 1944; Hershey and Chase, 1952). En 1953, Watson and Crick (1953a, b) sugieren un modelo tridimensional para su estructura y mecanismo de replicación, confirmados posteriormente.

De acuerdo con el modelo propuesto, el ADN es una molécula bicatenaria, constituída cada cadena por la secuencia de unidades químicas denominadas nucleótidos. Cada nucleótido está compuesto por una pentosa, la deoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada.

Los nucleótidos difieren solamente a nivel de las bases nitrogenadas, que son de dos tipos: las purinas, representadas por la guanina (G) y la adenina (A); y las pirimidinas, constituídas por la citosina (C) y la timina (T).

A lo largo de la cadena polinucleotídica, los nucleótidos se unen por uniones fosfodiéster, resultando una secuencia alternante azúcar-fosfato y emergiendo las bases nitrogenadas en forma perpendicular a esta estructura.

Las dos cadenas polinucleotídicas dextrohelicoidales, enrolladas sobre un mismo eje, constituyen una doble hélice. Cada una de ellas presenta una orientación de sus puentes fosfodiéster 3'-5' internucleotídicos opuesta a la de la otra, determinándose así el antiparalelismo de las cadenas.

Las bases nitrogenadas de una de las cadenas se aparean, sobre el mismo plano, con las emergentes de la otra cadena. Debido a problemas estéricos, sólo son posibles dos tipos de apareamiento: A-T y G-C, que son precisamente los que presentan una exacta equimolaridad en todos los ADNs estudiados (Chargaff, 1950). El par A-T está mantenido por dos puentes de hidrógeno, en tanto que el par G-C lo está por tres.

Las bases nitrogenadas son hidrofóbicas, ubicándose en el interior de la doble hélice, en tanto que los azúcares y fosfatos, por estar cargados eléctricamente, están expuestos al contacto con el agua. De esta manera, la estructura del ADN no sólo está mantenida por las uniones puente de hidrógeno, sino también por las interacciones hidrofóbicas generadas cooperativamente al apilarse las bases.

Las dos cadenas de la doble hélice no son idénticas, ni en composición ni en secuencia de nucleótidos, pero sí mutuamente complementarias: enfrentada a una T siempre habrá una A en la otra cadena, así como enfrentada a una C de una cadena siempre habra una G en la otra y viceversa. Esta complementariedad sólo puede darse en forma antiparalela, presentando una de las cadenas el sentido 5'-3' (determinado por las uniones fosfodiéster internucleotídicas), y la otra el sentido 3'-5'.

El modelo postulado por Watson y Crick sobre la estructura del ADN les permitió proponer, a la vez, un mecanismo de replicación: ya que las dos cadenas son complementarias, durante la replicación podría producirse la separación de las cadenas de la molécula, constituyendo cada una un molde sobre el que se sintetizaría la cadena hija, complementaria.

Como resultado, se obtendrían dos moléculas hijas, constituída cada una de ellas por una cadena parental y una sintetizada usando aquella como molde. Se plantearon así las bases de la replicación semiconservativa del ADN, posteriormente comprobada en forma experimental (Meselson and Stahl, 1958).

EL ADN EN LA IDENTIFICACION INDIVIDUAL: una revolución en la Bioquímica Forense.

A partir del descubrimiento de polimorfismos hipervariables en el ADN por Wyman and White (1980), y de la posibilidad de emplearlos en identificación humana, lograda por Jeffreys (1985), los rangos de probabilidad de exclusión se incrementaron enormemente, a más del 99,99 %, superando incluso a la aplicación de todos los sistemas anteriores en conjunto.

Reseña histórica

En orden cronológico, puede decirse que el puntapié inicial de los análisis de ADN se produce en abril de 1985, cuando el primer caso judicial es resuelto por aplicación de técnicas moleculares de caracterización de secuencias hipervariables en el ácido desoxirribonucleico (ADN) (Jeffreys et al., 1985a).

Los resultados obtenidos mediante el estudio de las Huellas Digitales Genéticas (HDG) o "DNA-Fingerprinting" permitieron aclarar una disputa por inmigración a Gran Bretaña (Jeffreys et al 1985b). Poco tiempo después, una corte civil inglesa acepta la evidencia de ADN en un caso de paternidad discutida.

El debut de esta prueba en la investigación criminal se produce en octubre de 1986, en un caso de homicidio en el que se comprobó la inocencia del principal sospechoso (Gill and Werret, 1987; Wong et al.,1987).

Recién a partir del año 1987, las pruebas de ADN son admitidas como evidencia en las Cortes Criminales de Gran Bretaña y de Estados Unidos.

En 1988 se desarrollan técnicas de amplificación de ADN de pequeñas regiones variables del genoma, partiendo de sólo 1700 células diploides, equivalentes a unos 10 nanogramos de ADN (Saiki et al, 1988).

Estas técnicas, denominadas genéricamente reacción en cadena de la polimerasa ("Polymerase Chain Reaction" o PCR), emplean iniciadores o primers, que son secuencias de ADN complementarias de las zonas flanqueantes de la zona de interés (Jeffreys et al, 1989), que es amplificado por una ADN polimerasa durante ciclos térmicos adecuados, lográndose millones de copias de la región.

En 1989, y a causa de estudios de dudosa verosimilitud efectuados por la empresa americana Lifecodes Corp. en un caso criminal, se discute en los Estados Unidos la validez científica de estas pruebas para uso forense (Lander, 1989), resultando en una revisión crítica de las técnicas utilizadas por los distintos grupos de investigadores.

En 1990, el U.S. Congress Office of Technology Assessment concluye que la identificación de individuos basada en las pruebas de ADN es científicamente válida, siempre que se disponga de la certeza metodológica de su realización. La estandarización de las mismas ha sido encarada, entre otros, por los laboratorios del FBI (FBI Academy, Quantico, 1989).

La razón fundamental de la amplia difusión de estas técnicas estriba en el hecho de que, mientras la serología clásica y los marcadores genéticos evaluables fenotípicamente presentan un número muy limitado de genotipos posibles, el continuo descubrimiento de nuevas regiones hipervariables en el ADN resuelve el problema de la identificación certera de individuos y del establecimiento de vínculos biológicos de parentesco (Chakraborty and Jin, 1993).

En los primeros trabajos con utilización de las técnicas de PCR, si bien resultaba posible evaluar regiones de una muestra de ADN que podía estar muy degradada, la escasa variabilidad entre los individuos componentes de la población general conspiraba contra la certeza incriminatoria del análisis: era factible que una evidencia coincidiera con un sospechoso por azar, y mucho más aún, que a un padre alegado le fuera atribuída erróneamente la paternidad biológica de un descendiente putativo.

A partir de los ´90, la posibilidad de evaluar un gran número de sitios variables localizados en diferentes zonas del genoma (Edwards et al, 1991), permitió analizar, aunque fuera parcialmente, muestras de tejido humano quemado y en estado de putrefacción, como el derivado del atentado a la Embajada de Israel (Corach et al, 1992).

Posteriormente, la incorporación de un número aún mayor de sistemas hizo posible el establecimiento de vínculos biológicos de parentesco a través de secuencias de ADN de muy pequeño tamaño, con lo cual se logró la identificación de cadáveres momificados, con reducción ósea total o quemados (Penacino and Corach, 1993; Penacino et al, 1994c).

LAS MULTIPLES ALTERNATIVAS DE ANALISIS

A la luz del conocimiento actual, los sistemas de análisis de ADN pueden dividirse en dos grandes grupos: los basados en diferente longitud de la región variable, debidos a VNTR (Variable Number Tandem Repeats - repeticiones en tandem de número variable), y los basados en diferencias en la secuencia nucleotídica.

Los polimorfismos de longitud pueden ponerse de manifiesto mediante enzimas de restricción (RFLPs) o por amplificación de la región variable. En ambos casos, el resultado observable es similar: diferentes individuos presentan distinta longitud de los fragmentos de ADN obtenidos luego del corte con la enzima de restricción seleccionada o de la amplificación de la región de interés.

Sistemas basados en diferente longitud de la región variable:

Evaluación de minisatélites:

Los minisatélites son regiones del genoma no codificantes, con más de 600 pares de bases de tamaño. En los que involucran unidades repetidas, cada una presenta, por lo general, entre 12 y pocos cientos de pares de bases. Pueden evaluarse mediante:

Transferencia del ADN a soportes sólidos (técnica de Southern):

Se emplea una sonda o probe complementaria de la región hipervariable. Las sondas se clasifican, de acuerdo con la localización y número de sitios que presentan sus secuencias complementarias en el genoma, como:

* De locus múltiple: Estas sondas reconocen ("hibridizan") a diferentes regiones del genoma, ubicadas en distintos cromosomas, cuya localización precisa se desconoce, produciendo DNA-fingerprints ("huellas digitales genéticas") individuo-específicos sobre una membrana que contiene ADN fragmentado enzimáticamente y separado por electroforesis. Las bandas obtenidas se heredan mendelianamente, por lo cual provienen en forma aproximada en un 50 % de cada uno de los progenitores.

Entre ellas, las denominadas 33.6 y 33.15, desarrolladas por Jeffreys (1985a) que detectan unos 17 fragmentos variables de DNA por individuo, de entre 3.5 y 20 kilobases, o bien el fago M13, que posee secuencias capaces de generar huellas digitales genéticas (HDG), individuo-específicas (Vassart et at, 1987).

Otro ejemplo de este tipo de sondas lo constituyen los oligonucleótidos, en secuencias repetidas 5 veces CAC/GTG que también son generadores de fingerprints (Nurnberg et al., 1989).

Si bien son sumamente informativas para caracterizar a un individuo, presentan dos inconvenientes que las hacen inapropiadas para los estudios forenses: por un lado, requieren un ADN en buen estado de conservación, de alto peso molecular, que no suele obtenerse a partir de muestras de interés forense; y por otro, dependen de variables experimentales de difícil estandarización, lo que hace casi imposible reproducir los resultados.

* De locus único o locus específicas: detectan un solo locus hipervariable con una banda por alelo; dada la naturaleza diploide de los humanos, se obtienen patrones de dos bandas (heterocigotas), o patrones de una banda (homocigotas, con alelos de similar tamaño).

Su variabilidad está dada por secuencias que se repiten un cierto número de veces, generándose fragmentos de restricción de diferente tamaño (VNTRs), más grandes cuanto más veces esté repetida dicha secuencia. Son altamente polimórficas, por ejemplo, para la sonda YNH24 se han detectado alrededor de 70 alelos de distinto tamaño en la población mundial.

Cabría esperar que esta multiplicidad produjera una muy alta capacidad resolutiva, sin embargo, algunos alelos se encuentran mucho más representados que otros en la población, por lo cual la mayor o menor certeza de los estudios efectuados dependerá de los análisis de las frecuencias poblacionales para cada variante alélica o banda, que presente cada sistema en particular. Estos estudios deben realizarse previamente sobre muestras tomadas al azar de individuos no relacionados, de aquella población de la cual emergen las muestras a ser analizadas.

La certeza del análisis puede incrementarse utilizando un conjunto de varios loci hipervariables (Wong et at, 1987; Smith et al, 1990), lo cual disminuye prácticamente a cero la probabilidad de error.

La Figura 1 resume esquemáticamente los pasos a seguir para el análisis de una muestra con una sonda de locus específico.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR o Polymerase Chain Reaction):

La amplificación mediante PCR requiere pequeñas secuencias de ADN sintético los que actuan como iniciadores o primers, que son complementarios de las regiones flanqueantes de la zona de interés. Se produce mediante varios ciclos (generalmente de 25 a 35), cada uno de los cuales consta usualmente de tres pasos, efectuados mediante cambios de temperatura:

I- Desnaturalización: ruptura de los puentes de hidrógeno, quedando el ADN como simple cadena.

II- Reasociación o annealing: los primers se reasocian a las zonas complementarias.

III- Extensión: se sintetiza ADN, con los nucleótidos y una ADN polimerasa que se hallan en la mezcla de reacción, generándose al final del proceso millones de copias de la región de interés.

Esquemáticamente, la reacción de amplificación se representa en la Figura 2.

Figura 2

El uso de la enzima termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus, denominada Taq polimerasa para la "extensión" (Saiki et al, 1988), permitió la automatización del proceso mediante el empleo de cicladores térmicos electrónicos. El análisis genético podría efectuarse, entonces, en forma eficiente y fidedigna aún a partir de una simple célula (Jeffreys et al.1988, 1990).

Si bien se detectaron varios sistemas de minisatélites analizables por amplificación por PCR y análisis del tamaño de los productos (Amp-FLP o Polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados) como el Apo B (Boerwinkle et al, 1989), el YNZ-22 (Wolff et al, 1988), y el COL2A1 (Wu et al, 1990), tal vez el sistema más difundido lo constituye la región altamente polimórfica, de gran tamaño, constituída por 16 pares de bases repetidas de 18 a 42 veces, que se halla ubicada en el locus D1S80 y presenta 22 alelos detectados en la población general (Budowle et al, 1991; Sajantila et al, 1991; Baechtel et al, 1993; Kloosterman et al, 1993).

Evaluación de microsatélites:

Cada unidad de repetición de los microsatélites posee entre 2 y 5 nucleótidos, por lo cual se requiere la amplificación por PCR y evaluación posterior mediante geles de poliacrilamida (PAGE), similares a los empleados en secuenciación de ADN, que permiten discriminar diferencias de longitud de sólo un nucleótido.

Estas pequeñas secuencias presentan un número variable de repeticiones en tándem (STRs o "short tandem repeats"), desarrollándose los "primers" necesarios para su amplificación. Edwards et al (1991) describen 10 sistemas distintos, localizados en los cromosomas 1, 4, 6, 7, 11, 12 y X, que involucran secuencias repetidas de 3 ó 4 bases. Desde entonces, se incorporaron un número creciente de microsatélites (Kimpton et al, 1992; Polymeropoulos et al, 1992; Wiegand et al, 1993; Hammond et al, 1994). (Figura 2 bis).

Figura 2 bis

Sistemas basados en diferencias en las secuencias nucleotídicas:

Variantes génicas nucleares

El primero y más difundido análisis con aplicación forense, es el que estudia una región localizada en el segundo exón del gen HLA-DQ-a del complejo mayor de histocompatibilidad (HMC). La corporación Cetus (USA) desarrolló un sistema que permite detectar, de esta región polimórfica, seis alelos diferentes, denominados 1.1, 1.2, 1.3, 2, 3 y 4, por lo cual existen 21 genotipos distintos en la población general (Higuchi et al, 1988; Saiki et al, 1989; Amplitype User Guide, 1990; Comey et al, 1993).

Posteriormente, Cetus Corp. implementó un sistema denominado "Polymarker", que incluye, además del mencionado HLA-DQ-a otros cinco loci variables: LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, y Gc. Cada uno de ellos presenta dos o tres alelos diferentes en la población general (Budowle, 1994).

Variantes de ADN mitocondrial

Dentro de los sistemas cuya variación reside en la secuencia de nucleótidos, merece especial atención el estudio del ADN presente en las mitocondrias. En el año 1981, Anderson y col. publican la secuencia completa del genoma mitocondrial (Anderson et al., 1981), de aproximadamente 16,5 Kb, que presenta una región no codificante, denominada D loop, donde se encuentra el origen de replicación, y que se caracteriza por presentar sitios con elevado índice de mutación.

Debido a que la información contenida en la secuencia mitocondrial es heredada a partir de la vía materna exclusivamente esto permite establecer vínculo de parentesco entre individuos maternalmente relacionados (Giles et al, 1980) El análisis de la secuencia permite diferenciar un individuo de otro de distinto linaje materno (Higuchi et al, 1988).

Esta característica, sumada a que cada célula contiene una gran cantidad de mitocondrias y por ello el genoma mitocondrial se halla mucho más representado que el contenido en el núcleo celular, hace que este sistema sea de suma utilidad, principalmente en los casos de material ampliamente degradado.

A partir del análisis de esta secuencia han sido caracterizados restos arqueológicos de varios miles de años de antigüedad, en los que fue factible obtener ADN mitocondrial relativamente bien conservado (Paabo, 1990).

Evolución metodológica y perspectivas

A partir de 1990, los análisis mediante PCR fueron ganando espacio en los laboratorios forenses, debido a la relativa simplicidad de sus técnicas, menor costo e interpretación sencilla de los resultados, pero por sobre todo por requerir ínfimas cantidades de ADN: actualmente, es posible partir de tan sólo un nanogramo para analizar cada uno de los sistemas variables.

En algunas muestras tales como pequeñas manchas de sangre o semen, saliva, pelos o cadáveres antiguos, constituye la única posibilidad de lograr una caracterización genética (Hagelberg et al, 1991; Jung et al, 1991; Comey et al, 1991, 1993; Blake et al, 1992; Uchihi et al, 1992; Walsh et al, 1992).

En nuestro país, el Servicio de Huellas Digitales Genéticas se hace cargo hacia fines de 1991, de los análisis judiciales que involucran estudios de ADN, fijando criterios de estandarización internacionalmente aceptados y estrategias de recolección y análisis de muestras forenses (Corach et al, 1993a; Penacino y Corach, 1993b).

Las muestras de interés forense a ser amplificadas mediante PCR requirieron tratamientos especiales en cuanto a la extracción y purificación del ADN, que fue encarado por varios equipos de investigación, lográndose métodos eficientes a partir de ínfimas cantidades de material (unos 3 microlitros de sangre) (Chelex protocols, 1990; Corach, 1991; Jung et al, 1991).

El desarrollo reciente de un método alternativo que utiliza bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) permite extraer ADN de huesos, dientes, piel y músculos humanos, con una notable reducción de contaminantes que dificultarían el análisis posterior (Corach et al, 1994a). Esta situación representa una gran ventaja respecto a los métodos tradicionales que emplean combinaciones de enzimas proteolíticas (proteinasa K, pronasa, etc.), y agentes caotrópicos (lauril sulfato de sodio, etc.).

Así, sintetizando la breve historia de la metodología empleada por la Biología Molecular Forense desde sus inicios, podemos observar cómo los análisis mediante sondas multilocus fueron reemplazados por las sondas de locus único, en caso de poder obtenerse ADN suficiente (alrededor de 200 nanogramos); y por sistemas de análisis basados en PCR si el ADN se encuentra en menor cantidad, ambos sistemas altamente reproducibles y de fácil interpretación (Hochmeister et al, 1991; Mangin et al, 1991; Mulhare et al, 1991).

Otra modificación de las técnicas tradicionales consiste en el paulatino abandono de los métodos que emplean isótopos radiactivos, que son reemplazados con eficiencia similar por sistemas quimioluminiscentes (Sheffield et al, 1992; FBI, 1993).

El desarrollo, validación y aplicación de nuevos sistemas a nivel mundial se ve reflejado en su incorporación en nuestro medio, en el Laboratorio del Servicio de Huellas Digitales Genéticas.

Controles de calidad

Ante el empleo de primers y sondas semejantes en todo el mundo, validadas para uso forense, se han encarado actualmente sistemas de control de calidad en Europa (a través de la EDNAP -European DNA Profiling-) y EEUU (mediante el TWGDAM -Technical Working Group on DNA Analysis Methods-) con el objeto de unificar criterios y evitar errores de interpretación (Schneider et al, 1991; Hicks et al, 1991).

En nuestro medio, el Servicio de Huellas Digitales Genéticas se somete periódicamente a estos controles de calidad. Efectivamente, dada la ausencia de laboratorios policiales o judiciales argentinos, destinados al estudio del ADN en casos criminales y civiles, surgió como una necesidad el desarrollo, puesta a punto y empleo en la resolución de casos judiciales de las técnicas que siguen las tendencias mundiales, de probada eficacia y confiabilidad, como así también de efectuar estudios de frecuencias poblacionales de grupos étnicos autóctonos (Ginther et al, 1993; Sala y col, 1993, 1994a).

 2.4 OBJETIVOS.

Los objetivos del presente estudio fueron los siguientes:

1.4.1- Desarrollar y perfeccionar técnicas de extracción y purificación de ADN a partir de fluídos biológicos (sangre y semen) y sus manchas.

1.4.2- Desarrollar y perfeccionar técnicas de extracción y purificación de ADN a partir de tejidos celulares obtenidos de cadáveres en diferente estado de conservación.

1.4.3- Desarrollar nuevos sistemas de caracterización molecular que resulten eficientes para el análisis de ADN altamente degradado, obtenido a partir de manchas de fluídos biológicos y/o restos humanos.

1.4.4- Establecer estrategias de recolección, manipulación y análisis de restos humanos emergentes de catástrofes en masa.

1.4.5- Sistematizar los conocimientos adquiridos referentes a la correlación entre las características tanatológicas del material de análisis y la investigación molecular basada en estudios de ADN.

3 MATERIALES

3.1-FLUIDOS CORPORALES:

Fluídos corporales obtenidos experimentalmente

En estado líquido (sin soporte):

Se emplearon muestras de sangre anticoagulada con EDTA al 5% y de semen sin tratamiento previo, obtenidas de donantes voluntarios.

Fluídos biológicos en soportes sólidos:

Manchas de Sangre.

Se emplearon, para la implementación de las técnicas de extracción y purificación de ADN, muestras de sangre de un mililitro cada una, voluntariamente cedidas por donantes.

Estas muestras fueron distribuídas sobre diferentes soportes: papel de diario, tela de algodón y vidrio. El material seco así depositado y expuesto a temperatura ambiente dentro del laboratorio, fue posteriormente empleado para extraer ADN. Con el objeto de evaluar la eficiencia de las técnicas de extracción usadas y comprobar la antigüedad máxima de las manchas a ser analizadas, las extracciones se llevaron a cabo sobre media mancha (equivalente a 0,5 mililitros de sangre), a intervalos regulares de tiempo (desde tiempo=0 hasta veinte meses).

Las muestras obtenidas se resumen en la tabla I.

Mezclas de Semen/sangre.

Para implementar y desarrollar sistemas eficientes de purificación de ADN a partir de mezclas de semen y sangre, semejante a las halladas en los hisopados obtenidos luego del ataque sexual, se depositaron sobre hebras de algodón muestras de sangre/semen en diferentes proporciones, entre 5 y 500 ul de cada fluído. La evaluación del sistema de extracción se realizó mediante la comparación de los patrones de hibridación obtenidos luego del sondeo con secuencias de locus específico. Las mezclas se prepararon de acuerdo a la tabla II.

TABLA II

Muestras obtenidas de casos reales

Muestras forenses provenientes de violaciones

Se analizaron los materiales que se detallan en la TABLA III. En éstas se considera cada caso en particular, numerado en forma correlativa (Caso nro.), el material analizado, de acuerdo a las siguientes abreviaturas y correspondiente detalle: HV, hisopado vaginal; HR, hisopado rectal; SD, sangre de la damnificada; SS, sangre del sospechoso; PR, prenda.

Los números indican cantidades de hisopados, muestras de sangre o prendas.

Otras muestras forenses que involucran fluídos biológicos en soportes sólidos:

(*) los casos 13, 14 y 23 corresponden a manchas de sangre embebidas y secas en condiciones óptimas, ya que las dos primeras fueron recibidas en el Servicio de Huellas Digitales Genéticas con motivo del Control de Calidad Internacional de EDNAP (European DNA Profiling), y la restante fué obtenida y remitida por un Laboratorio Forense provincial a los efectos del análisis.

(**) en las muestras correspondientes a los casos 5, 16 y 25 se observa abundante fauna (larvas e insectos), lo cual presupone una conservación inadecuada.

3.2 PELOS

 3.3 UÑAS

Se recibieron siete casos que involucraban uñas provenientes de cadáveres.

3.4 RESTOS HUMANOS

En colaboración con la Justicia Nacional y Juzgados Provinciales, se analizó material procedente de cadáveres en estado de descomposición diverso.

Muestras empleadas en el estudio comparativo de métodos de extracción de ADN (pK/SDS vs. CTAB).

TABLA V

Muestras utilizadas en la determinación de la eficiencia del análisis en material cadavérico

TABLA VI

Referencias: B: presencia de tejidos blandos; H: reducción completa (material óseo únicamente); Q: quemados; S: saponificado; M: momificado. Los números indican cantidad de cadáveres estudiados.

Muestras obtenidas en el atentado a la Embajada de Israel.

REFERENCIAS: TND: tejido no determinado.

+ a +++: descomposición aparente, de menor a mayor.

 Material procedente del atentado a la AMIA

TABLA VII

Muestras obtenidas en un incendio de barco en Río Gallegos (Santa Cruz)

* Material cadavérico

* Muestras de sangre: anticoaguladas con EDTA, pertenecientes a supuestos familiares biológicos de los fallecidos.

Muestras correspondientes a un choque e incendio de ómnibus en Santo Tomé (Corrientes)

* Material cadavérico

* Muestras sanguíneas

Anticoaguladas con EDTA 5% (1/10 de volumen), pertenecientes a supuestos familiares biológicos de los fallecidos.

3.5 REACTIVOS

ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA

Se disuelven 38 grs de acrilamida y 2 grs de metilen-bis-acrilamida en agua destilada y se lleva a 100 ml de Vf.

BROMURO DE ETIDIO (solución)

Disolver 100 mg de bromuro de etidio en 10 ml de agua. Centrifugar y descartar el precipitado, tres veces. Conservar a 4 ºC. IMPORTANTE: poderoso mutagénico, usar guantes descartables.

BUFFER SIEMBRA 6X (gel agarosa)

Mezclar 3 ml de glicerol con 7 ml de agua destilada y agregar unos 25 mg de azul de bromofenol, agitando hasta disolución. Centrifugar a 10000 xg y descartar el precipitado.

CHELEX

Colocar 5 grs. de la resina Chelex p100 (Bio-Rad) en una probeta de 100 ml. Llevar a volumen con agua destilada y agitar. Conservar en heladera. Agitar vigorosamente antes de cada uso.

ClNa 3M

Disolver 174,9 grs de cloruro de sodio en agua destilada. Llevar a Vf 1000.

CLOROFORMO/ISOAMILICO

Mezclar 240 ml de cloroformo con 10 ml de alcohol isoamílico; agregar 1 volumen de agua destilada y agitar vigorosamente. Conservar en agua.

COLORANTE DESNATURALIZANTE

Mezclar 9,5 ml de formamida con 0,5 ml de agua y agregar una pizca de xilencianol y otra de azul de bromofenol. Agitar bien, centrifugar a 10000 xg y descartar el precipitado.

COLORANTE NO DESNATURALIZANTE

Preparar una solución saturada de sacarosa en agua y agregar una pizca de xilencianol y otra de azul de bromofenol. Agitar bien, centrifugar a 10000 xg y descartar el precipitado.

CTAB

Disolver 2 grs. de bromuro de cetil trimetil amonio en una solución constituída por 47 ml de ClNa 3M, 10 ml de TRIS/ClH 1M pH: 7,5 y 40 ml de EDTA 0,5M pH: 8, calentando ligeramente para favorecer el proceso. Agregar 0,2 ml de mercaptoetanol y ajustar a 100 ml de Vf.

DTT

Disolver 0,77 grs. de ditiotreitol en 5 ml de agua destilada estéril. Conservar a -20 ºC.

EDTA 5%

Disolver 5 gramos de EDTA disódico en 80 ml. de agua destilada, ajustar a 100 ml de volumen final. Conservar a 4 ºC.

EDTA 0,5M pH: 8

Disolver 186,1 gramos de EDTA disódico en 800 ml de agua destilada. Agregar lentejas de hidróxido de sodio hasta pH: 8, con agitación constante. Llevar a Vf: 1000 ml.

EtOH/AMONIO

Disolver 12 mg de acetato de amonio en 100 ml de etanol absoluto. Conservar en heladera.

FENOL (Solución)

Fundir a baño maría el fenol sólido y llenar hasta la mitad un frasco color caramelo con el líquido resultante. Agregar 1 volumen de TRIS/ClH 1M pH: 7,5, 0,2% de 2-hidroxi quinolina y 0,2% de mercaptoetanol. Agitar bien hasta que se forme una emulsión, decantar hasta observar las dos fases y descartar la parte acuosa. Agregar nuevamente TRIS/ClH 1M pH: 7,5 y repetir el proceso varias veces, hasta que la fase acuosa conserve su pH original (7,5). Conservar en solución de TRIS/ClH 0,1M.

FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2

Disolver 137,5 grs de fosfato disódico heptahidratado en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 7,2 con ácido fosfórico. Llevar a Vf: 1000 ml.

LUMI-PHOS 530

Constituído por 4- metoxi-4-(3-fenil fosfato) espiro (1,2 dioxietano-3,2' adamantano) en una solución 0,75 M de 2 amino 2 metil 1 propanol.

SOLUCION PARA PCR (no radiactiva)

La solución debe contener 50 mM ClK, 10 mM tris/Cl (pH 8,3), 1,5-2,5 mM cloruro de magnesio, 1,0 uM de cada "primer" y 200 uM de cada dNTPs.

SOLUCION PARA PCR (radiactiva)

Similar a la anterior, excepto que la concentración de dATP debe ser de 20 uM en vez de 200 uM.

NaOH 1M

Disolver 40 grs de hidróxido de sodio en lentejas en 1 litro de agua destilada.

PROTEINASA K (solución)

Disolver 100 mg de proteinasa K liofilizada en 5 ml de agua destilada estéril.

SDS 10%

Disolver 100 grs de dodecil sulfato de sodio en 900 ml de agua caliente. Ajustar a pH 7,2 por agregado de unas gotas de ácido clorhídrico concentrado. Llevar a Vf: 1000 ml.

SOLUCION DE UNION

A 1 ml de etanol agregarle 5 ul de ácido acético glacial y 3 ul de "bind silane" (Promega). Mezclar por agitación.

SOLUCIONES PARA HLA-DQalfa.

1) BUFFER CITRATO

Disolver 18,4 grs de citrato de sodio trihidratado en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 5 con ácido cítrico monohidrato (unos 6 grs.). Llevar a Vf: 1000 ml.

2) 20X SSPE

Disolver 7,4 grs de EDTA disódico dihidrato en 800 ml de agua destilada. Agregar NaOH 10N hasta pH 6. Añadir 210 grs de ClNa y 27,6 grs de fosfato diácido de sodio monohidrato. Ajustar a pH 7,4 con unos 10 ml de NaOH 10N. Llevar a Vf: 1000 ml.

3) CROMOGENO

Agregar 30 ml de etanol absoluto al frasco que contiene tetrametilbencidina (Perkin-Elmer). Mantener en heladera, al abrigo de la luz y el aire.

4) AGUA OXIGENADA 3%

Agregar 0,3 ml de peróxido de hidrógeno 100 v a 9,7 ml de agua destilada.

5) SOLUCION DE HIBRIDIZACION

Para 8 muestras, mezclar 7 ml de 20X SSPE y 1,4 ml de SDS 10%. Llevar a 28 ml con agua destilada.

6) SOLUCION DE LAVADO

Mezclar 25 ml de 20X SSPE y 2 ml de SDS 10%. Llevar a 200 ml con agua destilada.

7) SOLUCION DE COLOR

Preparar inmediatamente antes del uso. Mezclar 80 ml de BUFFER CITRATO, 80 ul de AGUA OXIGENADA 3% y 4 ml de CROMOGENO.

SOLUCIONES PARA TRATAMIENTO DE MEMBRANAS CARGADAS

1) SOLUCION DE PREHIBRIDIZACION

Agregar 10 ml de SDS 10% a un litro de FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2.

2) MEZCLA DE HIBRIDIZACION

Disolver 10 grs. de caseína de Hammersten y 0,2 grs de azida sódica en un litro de "solución de prehibridización".

3) SOLUCION DE LAVADO

A 800 ml de agua destilada agregarle 10 ml de SDS 10% y 2 ml de FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2. Llevar a Vf: 1000 ml.

4) LAVADO FINAL

Preparar una solución 3,25M de 2-amino-2-metil-1-propanol y 4,4 mM de cloruro de magnesio.

5) SOLUCION DE DESHIBRIDIZACION

A 50 ml de agua destilada agregar 0,1 ml de SDS 10% y 2,5 ml de PROTEINASA K (solución). Llevar a 100 ml.

SOLUCIONES PARA TRATAMIENTO DE MEMBRANAS NEUTRAS

1) MEZCLA DE PREHIBRIDIZACION/HIBRIDIZACION

Agregar 5 ml de TWEEN 20 a un litro de FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2. Disolver en la solución resultante 10 grs. de caseína de Hammersten y 0,2 grs de azida sódica.

2) SOLUCION DE LAVADO

A 800 ml de agua destilada agregarle 5 ml de TWEEN 20 y 100 ml de FOSFATO DE SODIO 0,5M pH 7,2. Llevar a Vf: 1000 ml.

3) LAVADO FINAL

Mezclar 10 ml de TRIS/ClH 1M pH: 7,5 con 50 ml de ClNa 3M. Llevar a Vf: 1000 ml.

SSC 20X

Disolver 175,3 grs de ClNa y 88,2 grs de citrato de sodio en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 7 con NaOH 10M. Llevar a Vf: 1000 ml.

TBE 10X

Disolver 108 grs de tris base, 55 grs de ácido bórico y 7,4 grs de EDTA disódico en agua destilada. Llevar a Vf: 1000 ml.

T10E1

Mezclar 1 ml de TRIS/ClH 1M pH: 7,5 con con 0,2 ml de EDTA 0,5M pH: 8. Llevar a 100 ml con agua destilada.

T10E10

Mezclar 1 ml de TRIS/ClH 1M pH: 7,5 con con 2 ml de EDTA 0,5M pH: 8. Llevar a 100 ml con agua destilada.

TEC

Mezclar 100 ml de T10E10 con 3,3 ml de ClNa 3M.

TINCION CON PLATA

Solución detenedora: Llevar 200 ml de ácido acético glacial a 2 lts. con agua destilada.

Solución de tinción: Disolver 1 gr de nitrato de plata en 2 lts. de agua destilada. Agregar 3 ml de formaldehído. Preparar en el día de uso.

Solución reveladora: Disolver 60 grs de carbonato de sodio anhidro en 2 lts de agua destilada y enfriar en heladera. Inmediatamente antes del uso, agregar 3 ml de formaldehído y 400 ul de tiosulfato de sodio 10 mg/ml.

TRIS/ClH 1M pH: 7,5

Disolver 121,1 gramos de tris base en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 7,5 por agregado de ácido clorhídrico concentrado. Llevar a Vf: 1000 ml.

4.1 PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCION DE ADN:

Métodos que emplean proteinasa K/SDS.

Procedimiento seguido para extraer manchas de sangre.

Las manchas sobre tela o papel (3 mm2 de superficie) se resuspenden en 2 ml de TEC.

Se agrega 10 ul de Proteinasa K y 200 ul de SDS 10%.

Se incuba a 37 ºC durante 12 horas.

Las muestras se tratan con solventes orgánicos: dos veces con fenol y dos con Cloroformo/Isoamílico, recuperándose cada vez la fase acuosa. Este procedimiento permite extraer las proteínas y lípidos que impurifican el material genético.

Se agrega 1/10 de volumen de ClNa 3M y dos volúmenes de EtOH absoluto y centrifugan a 10000 xg. a efectos de precipitar el ADN.

Los precipitados son resuspendidos en T10E1 o en agua destilada.

Procedimiento seguido para extraer ADN a partir de muestras de sangre congelada.

Se parte de 3 ml de sangre congelada.

Las muestras congeladas son hemolizadas por calentamiento brusco a 42 ºC durante 20 minutos. Los glóbulos blancos son lavados por resuspensión y centrifugación con T10E10 hasta que se observa un pellet blanco (2 ó 3 lavados), libre de hemoglobina y pigmentos. El precipitado es resuspendido en 0,5 ml de TEC, adicionándose 5 ul de proteinasa K y 50 ul de SDS 10%; las muestras son incubadas a 37 ºC durante 12 horas. Los siguientes pasos son idénticos a los detallados anteriormente.

Extracción diferencial de ADN a partir de muestras combinadas (semen-sangre; semen-células de descamación).

Esta técnica requiere un paso intermedio mediante el cual es mayoritariamente eliminado el material proveniente de la víctima, enriqueciéndose proporcionalmente de esta forma la cantidad neta de ADN presente en las cabezas espermáticas.

Paso 1: separación del material de la víctima mediante digestión con pK/SDS/TEC e incubación durante 2 horas a 56 ºC: bajo estas condiciones las cabezas de los espermatozoides son resistentes al ataque proteolítico y del agente caotrópico. Se centrifuga a 13000 xg durante 10 minutos y retira el sobrenadante, que contiene ADN de la víctima.

Paso 2: El precipitado del paso anterior (espermatozoides), se resuspende nuevamente en pK/SDS/TEC y agregan 10 ul de DTT, un agente que permeabiliza la cabeza del espermatozoide. Se incuba a 56 ºC durante 12 horas.

Finalmente, con los líquidos obtenidos de ambos pasos, se procede a las extracciones con solventes orgánicos y precipitación del ADN como se indicara anteriormente.

En caso de tratarse de muestras de semen únicamente, no se realiza el "paso 1" (separación del material de la víctima).

Procedimiento rápido para la extracción de ADN a partir de sangre entera, semen, o manchas (micrométodo), aplicable al análisis por PCR:

Se desarrolló un método rápido y económico que parte de 30 microlitros de sangre, 5 ul de semen o de una porción de 4x4 mm de tela manchada, se incuba con 0,4 ml de TEC; 5 ul de pK y 40 ul de SDS 10 % (si se trata de semen, añadir además 5 ul de DTT), durante 20 min. a 60 ºC.

Se extrae sucesivamente con 1 ml de fenol y 1 ml de cloroformo.

Se agrega 1/10 de volumen de ClNa 3M y 2 volúmenes de etanol, centrifuga a 13000 xg durante 4 min., descarta el sobrenadante y resuspende en agua destilada.

Extracción de ADN con CTAB (material cadavérico).

Fue empleada la técnica de extracción mediada por la sal de amonio cuaternaria (Bromuro de Cetil Trimetil Amonio) (Corach, 1991), usada en nuestro laboratorio para extracciones de ADN a partir de diversas fuentes.

Los concentrados de glóbulos blancos o soportes conteniendo las manchas a ser analizadas son resuspendidos en 0,5 a 1 ml de solución de lisis CTAB (dependiendo del tamaño de la muestra).

Las muestras son incubadas durante 3 horas a 60 ºC.

Se extraen dos veces con Cloroformo/Isoamílico y precipitan con 2/3 de volumen de alcohol isopropílico.

El precipitado obtenido es lavado con EtOH/amonio.

Las muestras se resupenden en T10E1.

Extracción mediante resinas de intercambio iónico para ADN monocadena

Se colocan 3 ul de sangre, de semen o una porción manchada de tela o papel de 3x3 mm en 1,5 ml de agua destilada estéril.

Se incuba a temperatura ambiente 15 a 30 minutos y centrifuga a 13000 xg 2 ó 3 minutos.

Al precipitado resultante se le añaden 180 ul de solución de Chelex y 5 ul de DTT (éste último sólo para semen), e incuba a 56 ºC por 15 a 30 min.

Se hierve a 8 min y centrifuga nuevamente a 13000 xg, 2 a 3 min.

Para cada amplificación, se emplean 10 ul del líquido resultante.

Obtención de ADN para análisis por PCR mediante shock osmótico.

Se mezclan 2 ul de sangre entera y 8 ul de agua bidestilada estéril. Se utiliza 1 ul como templado para cada reacción de PCR.

Extracción mediante isotiocianato de guanidina.

Se agregan 100 ul de sangre entera a 1 ml de solución de isotiocianato de guanidina (DNAzol, GibcoBRL) y agita durante 2 minutos.

Centrifugar a 10000 xg 10 minutos y descartar el precipitado, constituído por restos celulares.

Recuperar el sobrenadante y precipitar el ADN con etanol como se indicara anteriormente.

4.2 PURIFICACION DEL ADN AISLADO:

Se emplearon los siguientes sistemas alternativos de eliminación de impurezas:

Precipitación salina:

Se agregan 2 volúmenes de etanol/amonio, centrifuga a 13000 xg, y resuspende el ADN en agua bidestilada estéril.

Diálisis:

Las bandas obtenidas por electroforesis en geles de agarosa y visualización con bromuro de etidio, se cortan y colocan en bolsas de diálisis juntamente con buffer TBE. Se efectúa la electroelución a 300 v, 1 a 3 hs., con 1 minuto adicional invirtiendo la polaridad. La solución obtenida se extrae con solventes orgánicos y precipita como fuera descripto anteriormente para la extracción de ADN a partir de manchas de sangre. Si el volumen es grande, se concentra con sec-butanol, que deshidrata la solución acuosa.

Sistemas de purificación basados en la adsorción del ADN a sílica:

* En "batch": se añade a la muestra 3 volúmenes de ioduro de sodio 6 M y 5 ul de suspensión de sílica (GENECLEAN II, BIO 101 Inc, La Jolla, CA) en agua, se agita y coloca en baño de hielo durante 5 minutos. Se centrifuga, descarta el sobrenadante y lava el precipitado varias veces con etanol 70 %. Finalmente, se recupera el ADN agregando 30 ul de agua e incubando a 55 ºC durante 3 min.

* Por filtración: se agrega a la muestra 4,5 volúmenes de ioduro de sodio 6 M y la solución resultante se filtra a través de una membrana de sílica (GlassMAX DNA Isolation Spin Cartridge System, GIBCO, USA). Se centrifuga a 13000 g y lava repetidas veces con etanol 70 % a 4 grados centígrados, centrifugándose cada vez hasta la desaparición del líquido. El ADN se eluye agregando 40 ul de agua a 65 ºC y centrifugando durante 20 segundos.

4.3 CUANTIFICACION DEL ADN PURIFICADO:

Se utilizaron cuatro métodos alternativos:

Absorción de luz ultravioleta:

Se efectuó a partir de diluciones 1/200 a 1/500 en agua destilada, para determinar la absorción de luz UV a las longitudes de onda 230, 260, 280 y 320 nm en un espectrofotómetro Gilforg 250. Las relaciones 260/280 y 260/230 permitieron detectar la presencia de posibles contaminantes en las muestras. Se calcula el contenido de ADN asumiendo que una unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 50 ug/ml de ADN doble cadena.

Agarosa/bromuro de etidio:

Se utilizó un gel de agarosa al 1% en buffer TBE, con solución de bromuro de etidio y posterior corrida electroforética con el gel sumergido en TBE/bromuro de etidio, 20 minutos a 4 v./cm.

Se observa al UV en transiluminador y compara la intensidad de la fluorescencia con la emitida por testigos de concentración conocida.

Sistema colorimétrico:

Consiste en colocar 1 ul de muestra sobre una banda de nylon y sumergir la misma sucesivamente en soluciones que generan una reacción de color con los ácidos nucleicos (ADN y ARN) (FastCheck Nucleic Acid Quantificaction System, GIBCO, USA). Finalmente, se compara la señal producida con estándares de concentración conocida.

Hibridización con sondas humano-específicas:

Se llevó a cabo por hibridización de la muestra que contiene ADN, fija en una membrana de nylon, con la sonda D17Z1 (Walsh et al, 1992), marcada con fosfatasa alcalina y visualización con Lumiphos 530 (ver "hibridización").

Los resultados obtenidos se comparan con diluciones decrecientes de un patrón de ADN de concentración conocida.

4.4 ANALISIS DE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR

Corte del ADN con enzimas de restricción:

- Se agrega a una solución que contiene 1-10 ug de ADN, un volumen de agua destilada suficiente para obtener un volumen final de 150 ul, descontando 15 ul de tampón (buffer provisto por el fabricante de la enzima), que se agrega a continuación, y 50 unidades (aprox. 5 ul) de la enzima de restricción a ser empleada. Las más frecuentemente usadas en el campo de la identificación son: Hae III, Hinf I o Pst.

- Se incuba a 37 ºC durante 3 horas.

- Se lleva a 0,3 M de ClNa y 70 % de etanol.

- Se coloca 1 hora a -70 ºC, centrifuga y resuspende en 10 ul de agua destilada.

Evaluación del corte del ADN:

Se efectúa mediante un gel de agarosa al 1 %, teñido con bromuro de etidio, similar al empleado en "cuantificación de ADN", y comparando el resultado obtenido con un testigo de ADN cortado con la misma enzima.

Separación electroforética:

- Se prepara un gel de agarosa al 0,8 % en TBE y siembran las muestras, reservando algunos caminos para los marcadores de peso molecular conocido y controles internos como el denominado K562.

- Se corre 16 horas o 24 horas (dependiendo de las sondas que serán usadas posteriormente), a 40 volts en geles de 20 cm. de longitud.

- Se colorea con bromuro de etidio y fotografía al UV.

Transferencia del ADN a soportes sólidos (técnica de Southern):

Para membranas con carga positiva:

- Se arma el dispositivo consistente en un recipiente plástico que contiene NaOH 0,5 M/ ClNa 0,5 M (solución de transferencia), sobre el cual se coloca una placa de vidrio y encima de ésta, una tira de papel Whatman 3MM que pesca en el líquido. Sucesivamente, se ubica el gel, una membrana de nylon cargada positivamente (BIODYNE B, Gibco BRL), papeles de filtro cortados del tamaño del gel, servilletas de papel y por último, una placa pesada.

En estas condiciones, se producen simultáneamente la desnaturalización del ADN por efecto de la solución alcalina y su transferencia del gel a la membrana, debido a la fuerza ascendente del líquido por capilaridad, que "arrastra" al material genético.

- Se transfiere durante 16 horas.

- La membrana se lava con 2xSSC, dos veces.

Para membranas neutras

- Se requiere un paso previo a la transferencia, que consiste en desnaturalizar el ADN contenido en el gel con 1,5M ClNa / 0,5M NaOH durante 15 minutos.

- Enjuagar con agua destilada y neutralizar con 1,5M ClNa / 0,5M Tris (2 lavados de 15 minutos cada uno).

- Se arma un dispositivo similar al anterior, pero empleando un membrana neutra (BIODYNE A, Gibco BRL) y 10x SSC como solución de transferencia.

- Se transfiere durante 16 horas.

- Tratar la membrana con 0,2M Tris / 2x SSC (2 lavados de 15 minutos c/u).

- Exponer al UV durante 40 segundos y hornear a 80 ºC 30 minutos, a los efectos de fijar el ADN a la membrana.

Sondas empleadas en el presente trabajo.

Radiactivas

- De locus múltiple: M13 (Vassart et al, 1987).

- De locus único: YNH24 (Nakamura et al, 1987) (locus D2S44).

Marcación por "Random Primers":

- Desnaturalización del inserto (aislado previamente de la construcción por clivaje con Eco R1) en baño de agua hirviendo durante 5 minutos.

- Agregado de 2 ul de dATP, dGTP y dTTP, 15 ul de buffer (provisto por BRL), y 5 ul de 32P-dCTP, llevando a un volumen final de 49 ul con agua destilada, para agregar finalmente 1 ul de fragmento klenow.

- Incubación a 25 ºC 1 hora.

- Agregado de 5 ul de EDTA 0,5m para detener la reacción y separación mediante una columna de Sephadex G-50 Medium.

- Desnaturalización con NaOH 1,5 M durante 10 minutos.

- Neutralización con ClH 1,5 M.

Quimioluminiscentes:

Se utilizaron las siguientes sondas de locus específico, a las que se les ha incorporado al nucleótido en 5', previamente modificado por el agregado de un grupo amino, una molécula de fosfatasa alcalina:

Hibridización y detección:

- Se lleva a cabo una "prehibridización", incubando la membrana en una solución que contiene 0,25 % de leche en polvo descremada y 6xSSC, toda la noche a 55 ºC.

- Se agrega la sonda marcada con a32P y deja 16 hs. a 55 ºC (para la sonda M13) o a 60 ºC (para YNH-24), lavándose posteriormente con soluciones de 2xSSC / 0,1% SDS, luego 1x SSC y finalmente 0,5x SSC, manteniendo constante la concentración de SDS; controlando cada paso con un monitor Geiger-Müller.

- Se coloca la membrana en contacto con una película radiográfica, durante 16 horas a -70 grados, al cabo de las cuales se procede al revelado y evaluación de los resultados obtenidos.

Deshibridización:

- Lavar la membrana dos veces con agua destilada, a 90 ºC.

Métodos quimioluminiscentes:

*Para membranas cargadas:

- Colocar la membrana en contacto con la "solución de prehibridización" a 55 ºC, 20 minutos, con agitación.

- Reemplazar el líquido por la "mezcla de hibridización" y agregar la/s sonda/s (habitualmente, una de "locus único" y otra de un "ladder" de peso molecular) marcada/s con fosfatasa alcalina. Incubar a 55 ºC durante 10 a 30 minutos (el tiempo depende de la sonda utilizada).

- Tratar dos veces con "solución de lavado", 10 minutos c/u a 55 ºC y dos veces con "lavado final", 10 minutos c/u a temperatura ambiente.

- Se escurre la membrana sobre papel Watmann 3MM, coloca entre dos hojas de polietileno y agrega 1 ml de LUMIPHOS 530 (Gibco, BRL).

- Se expone a una placa radiográfica durante 1 hora y revela.

Deshibridización:

- Incubar la membrana con "solución de deshibridización", 1 hora a 65 ºC.

- Lavar dos veces a temperatura ambiente con 0,1% SDS / 5x SSC.

- Incubar en formamida 50% / 10 mM fosfato de sodio, a 65 ºC 1 hora.

- Lavar dos veces con 2x SSC, a temperatura ambiente (conservar húmeda hasta el resondeo).

*Para membranas neutras:

El protocolo para la hibridización es similar, pero cambia la composición de las soluciones (ver capítulo "Reactivos", del presente trabajo).

Deshibridización:

- Incubar la membrana 30 minutos a 65 ºC, en 0,1% SDS.

- Humedecer con 2x SSC y conservar en esas condiciones hasta el resondeo.

4.5 ANALISIS DE ADN EN CONDICIONES VARIABLES DE DEGRADACION: los métodos de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).

Preparación de la muestra:

- Se coloca en cada tubo 30 ul de "mezcla para PCR" (radiactiva o no, según se desee).

- Se agrega una porción de muestra que contenga de 1 a 50 nanogramos de ADN (1 a 3 ul) y 1,5 U de Taq polimerasa.

- Cuando se emplean métodos radiactivos, se adiciona finalmente 1 uCi de a32P-dATP.

Marcadores empleados en el presente trabajo

* Ubicados en los cromosomas autosómicos

* Ubicados en los cromosomas sexuales

Nota: para los marcadores del Y se menciona su ubicación en el GDB-ID.

Condiciones de amplificación:

La amplificación se efectúa mediante varios ciclos, cada uno de los cuales consta de desnaturalización (se separan las cadenas del ADN), reasociación (se produce la unión de los iniciadores o "primers" a las secuencias complementarias) y extensión (se sintetizan nuevas moléculas de ADN).

* Para todos los sistemas, excepto HLA-DQa, D1S80 e YCA II, se emplea el siguiente ciclado:

- 94 ºC 1 min.; 60 ºC 1 min.; 70 ºC 1,5 min.: 10 ciclos.

- Luego 90 ºC 1 min.; 60 ºC 1 min.; 70 ºC 1,5 min.: 20 ciclos.

* Para HLA-DQa: 94 ºC 60 seg.; 60 ºC 30 seg.; 72 ºC 30 seg.: 32 ciclos. Luego, una extensión final de 7 min. a 72 ºC.

* Para D1S80: 95 ºC 10 seg.; 67 ºC 10 seg.; 70 ºC 30 seg.: 27 ciclos.

* Para YCA II: 94 ºC 60 seg.; 45 ºC 60 seg.; 72 ºC 90 seg.: 30 ciclos.

Electroforesis (todos los sistemas excepto HLA-DQa):

* Para todos los sistemas, exceptoD1S80:

Se prepara un gel de poliacrilamida (PAGE) desnaturalizante, del siguiente modo:

- Tratar una de las placas de cristal con silicona (SigmaCote u otras), con ayuda de toallas de papel, y secar cuidadosamente.

- Para una cuba modelo S2 (Gibco BRL), mezclar 49,5 grs. de urea, 46 ml. de agua destilada y 5 ml. de TBE 10x. Disolver con calentamiento suave y agitación. Añadir 10 ml. de solución de acrilamida/bisacrilamida 38:2.

- Finalmente, agregar los catalizadores: 200 ul de persulfato de amonio 10% y 32 ul de TEMED. Mezclar bien y volcar en menos de 2 minutos entre dos placas de cristal (una de ellas siliconada, como se indicó antes), cuidando que no queden burbujas.

Se deja solidificar durante una hora y coloca en una cuba vertical con buffer TBE 0,5X, a 60 mA (con voltaje y wattaje libres) unos 30 minutos.

A la muestra se le agrega 1 volumen de "colorante desnaturalizante" y se siembra en las cavidades del gel. La corrida electroforética se efectúa durante 60-90 minutos, según el peso molecular de los productos de amplificación, en las condiciones mencionadas.

* Para D1S80:

Se prepara un gel de poliacrilamida no desnaturalizante del siguiente modo:

-Tratar una de las placas de cristal con "solución de unión" y esparcirla mediante toallas de papel absorbente, retirando el exceso hasta que quede totalmente seco.

-Tratar la otra placa con silicona, con ayuda de toallas de papel y secar cuidadosamente. Evitar que cada una de las placas entre en contacto con la otra, a través de las toallas, manos, esponjas, etc., ya que ello provocaría la adhesión parcial y rotura del gel.

-Para un gel de 19,5 cm x 37 cm, mezclar 30 ml de agua destilada, 2 ml de TBE 10x y 8 ml de solución de acrilamida (GeneAmp Detection Gel, Perkin-Elmer).

-Agregar 120 ul de persulfato de amonio 10% y 20 ul de TEMED. Volcar antes de 2 minutos y dejar solidificar por una hora.

-Se mezclan 5 ul de amplificado con 1 ul de "colorante no desnaturalizante" y se siembra en las cavidades del gel. La corrida electroforética se efectúa durante 90 minutos.

Visualización de los resultados:

* Métodos radiactivos:

Los resultados se visualizan mediante autorradiografía, colocando una placa radiográfica KODAK OMAT en contacto con el gel, adherido a un papel de filtro. La exposición se efectúa a -70 ºC, durante un lapso que puede variar, según la intensidad de la señal, entre 2 hs. y 3 días.

* Métodos no radiactivos (todos los sistemas excepto HLA-DQa):

Tinción con bromuro de etidio: se sumerge el gel en una solución de TBE 0,5X con 0,01 mg % de bromuro de etidio. Se observa la flourescencia emitida por los ácidos nucleicos al UV.

Tinción con nitrato de plata: es conveniente adherir previamente el gel a la placa de cristal, como se indicó antes.

El tratamiento consiste en:

- Separar las placas, observando que el gel se adhiere a la más corta.

- Colocarla en 1 litro de "solución detenedora", unos 20 minutos con agitación (esta etapa puede prolongarse hasta varias horas, si se desea). Reservar el líquido para el último paso.

- Lavar con agua destilada, tres veces de 2 min. c/u, escurriendo bien cada vez.

- Agregar la "solución de tinción", agitando durante 30 minutos.

- Lavar el gel muy brevemente, no más de 5 segundos, con agua destilada, y agregar la mitad de la "solución reveladora". Agitar hasta que las bandas comienzan a hacerse visibles.

- Descartar el líquido y agregar la otra mitad de la "solución reveladora". Dejar 2-3 min. y descartar.

- Lavar con agua destilada 2 min. y agregar la "solución detenedora".

- Lavar el gel dos veces con agua destilada y secar. Fotocopiar, fotografiar o levantar con "scanner" para almacenar los resultados.

* Hibridización y detección de HLA-DQa:

- Incubar los amplificados a 95ºC, de 3 a 10 minutos.

- Colocar una tira en cada canaleta de la bandeja provista (Perkin-Elmer).

- Preparar por cada muestra 3,3 ml. de solución de hibridización con 27 ul de enzima conjugada (Perkin-Elmer) y colocar 3 ml de mezcla en cada canaleta.

- Agregar 35 ul de cada amplificado a cada tira, e incubar a 55ºC, 20 minutos.

- Retirar todo el líquido de cada canaleta y agregar 10 ml de solución de lavado. Incubar a 55ºC, 12 minutos.

- Retirar el líquido y agregar otros 10 ml, incubando a temperatura ambiente 5 minutos.

- Agregar 10 ml de solución de color. Incubar a temperatura ambiente hasta que los puntos azules se observen nítidamente.

- Retirar el líquido y lavar 3 veces con agua destilada (10 min. c/u), a temperatura ambiente.

- Secar las tiras y fotocopiar con láser color para preservar los resultados.

Evaluación de la eficiencia del análisis

La eficiencia fué determinada como:

nro. de sistemas con resultado positivo x 100

nro. total de sistemas empleados

4.6 DESARROLLO DE SISTEMAS "MULTIPLEX" DE APLICACION FORENSE.

Se seleccionaron aquellas combinaciones de sistemas compatibles en base al peso molecular del amplificado, composición de iniciadores o "primers" y condiciones de ciclado, que permitieran su amplificación en una sola mezcla de reacción.

La puesta a punto se realizó mediante experimentos sucesivos en diferentes condiciones de:

* Concentración de magnesio (de 1 a 2,5 uM).

* Ciclado, empleándose alternativamente el mencionado anteriormente (ver el punto "Condiciones de amplificación") y el propuesto por Edwards et al (1991).

* Concentración de cada iniciador o "primer" (0,1uM, 1 uM y 10 uM).

Combinaciones empleadas:

* HUMFES / HUMVWA

* HUMTHO1 / HUMFABP / HUMHPRTB

* DYS 390 / DYS 391

* DYS 392 / DYS 393

* Determinación de sexo y caracterización parcial de muestras de interés forense: se combinaron los sistemas polimórficos HUMHPRTB (1 uM), DYS19 (1 uM) y el monomórfico Y (0,01 uM).

Uno de los sistemas polimórficos se encuentra ubicado en el cromosoma X (HUMHPRTB) y el otro en el cromosoma Y (DYS19). El sistema monomórfico se halla también en el cromosoma Y.

La amplificación del DYS19 y la observación de una sola banda en el HUMHPRTB (hemicigosis) confirman el origen masculino de la muestra; por el contrario, la ausencia de amplificación del primero y dos bandas en el segundo corresponden indudablemente a una mujer.

A los efectos de confirmar el sexo del individuo, se analiza simultáneamente con los anteriores una secuencia específica del cromosoma Y, altamente sensible, útil principalmente en los casos de mujeres homocigota para HUMHPRTB.

Los sistemas combinados se resumen en el siguiente cuadro:

Mezcla de amplificados

Con sistemas incompatibles en cuanto a alguna o todas las condiciones mencionadas anteriormente, pero cuyos productos de amplificación poseen diferente peso molecular, se mezclaron los mencionados productos a los efectos de sembrar las muestras amplificadas mediante distintos sistemas en un sólo punto ("multiloading"). Por ejemplo, es factible la mezcla del dúplex DYS390/DYS391 con el sistema YCAII, que poseen diferente ciclado, ahorrándose un camino del gel de poliacrilamida.

5 RESULTADOS

5.1 ANALISIS DE FLUIDOS CORPORALES.

En una primera etapa se analizaron muestras de sangre y semen obtenidas de donantes, tanto en estado líquido como en manchas, para evaluar la eficiencia de los diferentes métodos de extracción de ADN.

Posteriormente, se aplicaron las metodologías que resultaron más eficientes a muestras forenses que involucraban fluídos biológicos en diferentes soportes, tales como las procedentes de violaciones y homicidios.

Estudio de fluídos corporales obtenidos experimentalmente

En estado líquido (sin soporte):

Los resultados obtenidos a partir de muestras de sangre y semen se detallan en la tabla VIII.

TABLA VIII

NOTA: La evaluación de la cantidad comparativa de ADN obtenido se efectuó mediante el método que emplea bromuro de etidio.

El ADN extraído de sangre y de semen, con diferentes métodos, arrojó como resultado que los que emplean proteinasa K / SDS, incluyendo el micrométodo, permiten una mayor recuperación del ácido nucleico que los que utilizan CTAB, posibilitando tanto una eficiente amplificación por PCR como una adecuada evaluación mediante Southern blot.

Las razones de este mayor rendimiento podrían hallarse en que los métodos enzimáticos, con la acción simultánea de proteasas como la mencionada y el detergente SDS, son más drásticos que los que emplean solamente un detergente (el CTAB), destruyendo completamente las estructuras celulares.

Sin embargo, esta situación también incrementa notablemente el nivel de impurezas que coprecipitan con el ADN, requiriendo en algunos casos tratamientos adicionales de purificación.

El micrométodo presenta las mismas ventajas y limitaciones, pero permite la obtención de material analizable por PCR en apenas una hora, desde el momento de la toma de muestra, a diferencia de los restantes métodos que requieren varias horas.

La extracción mediante chelex, si bien es un proceso rápido y sencillo, sólo aísla ADN monocadena útil para PCR, pero persiste en la solución que contiene el ácido nucleico un alto nivel de impurezas, que en algunos casos dificulta el proceso de amplificación.

Fluídos biológicos en soportes sólidos.

Manchas de sangre:

El ADN extraído de sangre en diferentes soportes, arrojó como resultado que el vidrio permite una mayor recuperación del ácido nucleico, seguido por el papel de diario y la tela de algodón.

El paso del tiempo en las manchas secas no mostró reducción en el rendimiento de la extracción, como tampoco una diferencia notable en cuanto a la presencia de ADN de bajo peso molecular (degradado).

Los resultados obtenidos se expresan en la tabla IX.

TABLA IX

La más eficiente recuperación de ADN en manchas sobre una superficie lisa, no porosa, como el vidrio, se explica por cuanto permite mantener una mayor integridad de las células, evitando fenómenos de adsorción, absorción y reacción química con los componentes del soporte, tanto más factibles cuanto más poroso es éste. Tal lo ocurrido con la tela de algodón, y en menor medida, con el papel de diario.

Mezclas de semen/sangre:

La técnica implementada resultó altamente satisfactoria para la separación del ADN correspondiente a la sangre, del ADN proveniente del semen. Ello se comprobó al observarse cuatro alelos, dos en cada etapa de la separación, correspondientes a los dos individuos donantes de los fluídos. La cantidad relativa de ADN aislado en cada etapa se esquematiza en la tabla X.

TABLA X

A partir de la muestra 3 (que contiene 50 ul de semen), fué posible aislar suficiente ADN seminal como para hacer posible su evaluación con sondas de locus único.

La evaluación del ADN obtenido del semen es posible por cuanto se observa con sondas de locus único como bandas mucho más intensas que las provenientes de la sangre, apenas perceptibles, por lo cual resulta de gran utilidad en la identificación de individuos responsables de casos de violación.

El método se fundamenta en que en la primera etapa, de hidrólisis enzimática suave, sólo son afectadas las células de la víctima (no espermáticas), cuyo ADN se aísla y purifica, separándose por centrifugación los espermatozoides.

En la segunda etapa, una hidrólisis drástica, que utiliza un tiol como permeabilizante, destruye los espermatozoides liberando su ADN.

Muestras obtenidas de casos reales

Una vez evaluada la capacidad de cada uno de los métodos de aislamiento de ADN con muestras obtenidas de donantes, se procedió a su empleo en muestras forenses provenientes de hechos reales, en cooperación con Poderes Judiciales de la Nación y Provinciales.

Muestras forenses provenientes de violaciones

Se analizaron manchas e hisopados conteniendo mezclas de semen y fluídos no seminales a los efectos de evaluar la eficiencia de los métodos de purificación.

Se estudiaron los casos 1 a 15 sin tratamiento posterior del ADN extraído; y las muestras 16 a 41 con purificación previa. Se obtuvieron los resultados que se detallan en las Tablas XI y XII.

Se emplearon métodos de transferencia (Southern blot) y sondeo únicamente a los efectos de confirmar la inclusión de un sospechoso. Por lo tanto, los casos en que se halló ADN de origen masculino pero sin contar con material biológico de los sospechosos, o que éstos resultaron excluídos por PCR, se resolvieron sin utilizar Southern blot (SB).

TABLA XI (sin purificación)

Si bien las técnicas implementadas para el análisis de manchas e hisopados resultaron altamente satisfactorias para la separación del ADN correspondiente al material no seminal (sangre, células de descamación, etc.), del ADN proveniente del semen, la mayoría de los casos analizados en una primera etapa (Tabla XI, sin purificación), no permitieron lograr resultados positivos, ni siquiera en los hisopados, que necesariamente deberían contener material celular femenino.

Ante la observación de que, en todos los casos, el material llegó a nuestro Laboratorio en condiciones inapropiadas (generalmente húmedo, a veces sumergido en medios de cultivo para bacterias), el resultado negativo fué atribuído a la degradación del ADN presente originalmente en los mencionados hisopados.

Considerando que en nuestro país, desde la denuncia de la violación, hasta la obtención de la muestra por parte del médico forense transcurrían varias horas, y aún días, podría explicarse la ausencia de ADN seminal en los casos mencionados. Naturalmente, otras posibilidades serían que no hubiera habido emisión de semen, o que ni siquiera hubiera existido violación.

En todas las situaciones en que se observa la presencia aparente de semen, logra extraerse suficiente ADN como para ser evaluados mediante transferencia a soportes sólidos (Southern blot) y PCR. En cambio, la ausencia aparente de semen, no implica la ausencia de resultados.

TABLA XII (con purificación)

La Tabla XIII presenta la comparación de los resultados obtenidos en ambas tablas anteriores:

TABLA XIII

La Figura 3 representa gráficamente los valores tabulados en la Tabla XIII.

FIG. 3

Con el desarrollo de nuevos métodos de purificación de ADN (Tabla XII), el porcentaje de resultados positivos, tanto en cuanto al hallazgo de material femenino como masculino, prácticamente se duplicó, reduciéndose notoriamente el número de muestras a partir de las cuales no se obtuvo material analizable.

La implementación de una estrategia de análisis consistente en utilizar los métodos de transferencia y sondeo únicamente en los casos en que el material de origen masculino coincidía con el sospechoso para todos los sistemas de STRs (short tandem repeats), permitió confirmar la inclusión en todos los casos, por lo cual podría concluírse que analizando un gran número de STRs podría prescindirse del Southern blot, mucho más engorroso y lento que la PCR.

Otras muestras forenses que involucran fluídos biológicos sobre soportes sólidos.

Se seleccionaron diferentes materiales con manchas de fluídos biológicos, a efectos de comparar con los resultados obtenidos a partir de muestras provenientes de donantes (ver punto 4.1.1.2 del presente trabajo).

Los materiales se clasificaron previo al análisis en:

* absorbentes: sobre telas o papel de filtro,

* parcialmente absorbentes: sobre hojas de cuaderno o de diario, colillas de cigarrillos, piso de cemento, madera sin lustrar, y

* no absorbentes: sobre metal, látex, plástico, piel.

NOTA: el promedio fué calculado excluyendo aquellos materiales que no presentaban manchas observables a simple vista (arrojaron resultado negativo en todos los casos).

En coincidencia con las condiciones experimentales, se observa una mayor eficiencia del análisis en manchas sobre soportes no absorbentes, que permiten mantener una mayor integridad de las células, evitando fenómenos de adsorción, absorción y reacción química con los componentes del soporte.

Sin embargo, en estos casos prácticos se detecta una gran amplitud de valores, que van de 0 a 100 % en una misma columna, que puede atribuírse a la enorme influencia que poseen sobre el resultado las condiciones de conservación de las muestras, por encima del soporte en el que se encuentran.

Obsérvese que las muestras de los casos 5, 16 y 25 presentan abundante fauna (larvas e insectos), lo cual hace presumir una conservación inadecuada, con calor y humedad, que pudo haber degradado el ADN existente, a juzgar por el resultado negativo obtenido.

En cambio, las muestras 13, 14 y 23, obtenidas sobre papel de filtro o tela libre de impurezas en condiciones de Laboratorio, desecadas antes de su remisión a nuestro Servicio, permitieron su análisis con todos los sistemas disponibles.

En los casos en que se observan manchas aparentemente de sangre y no hay evidencias de conservación inapropiada (por ejemplo, los nros. 4 y 12), debe considerarse la posibilidad que las manchas no correspondan a sangre o bien que no sea humana, ya que resulta habitual que el material de pericia sea remitido sin habérsele efectuado los ensayos previos para establecer si se trata de sangre, y en caso positivo, especie a que pertenece.

En el análisis empleando los métodos de purificación, se observa un notorio incremento de la eficiencia para los tres tipos de soporte en que se encuentra el fluído biológico, en concordancia con los resultados expuestos previamente en los casos de violación.

5.2 ANALISIS DE PELOS

Los pelos analizados fueron hallados en el lugar en hechos delictivos, y remitidos a los efectos de su comparación con sospechosos.

Los estudios que involucran pelos poseen una eficiencia relativamente baja, que en ningún caso llega al 100 %, debido fundamentalmente a las escasas células nucleadas que contienen los cabellos, localizadas casi exclusivamente en el bulbo piloso y su cubierta epidérmica.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo desaconsejan intentar el análisis de pelos sin bulbo con los marcadores empleados, ya que no fué posible aislar ADN a partir de ninguno de ellos. En consecuencia, deben arrancarse (y no cortarse) los cabellos destinados al estudio genético, y no elegir este tipo de muestra si se puede optar por otra más eficiente (sangre, semen, uñas, músculo en buen estado).

Cuando es necesario analizar pelos sin bulbo para su comparación con un sospechoso de un delito, resulta conveniente utilizar otros medios: comparación microscópica y determinación de índice medular e índice escamoso.

Los métodos de purificación permitieron aumentar notablemente (más de un 50%) la eficiencia del análisis de los pelos con bulbo.

 5.3 ANALISIS DE UÑAS

Se analizaron uñas de cadáveres que habían sido remitidas con el objeto de establecer, si era factible, el patrón genético de algún material biológico (sangre, piel) que pudiera estar presente debajo de las mismas.

NOTA: en todos los casos estudiados sólo se obtuvo ADN de la víctima.

A pesar de no haber sido de utilidad en cuanto a la investigación criminal, los resultados obtenidos revelan que las uñas constituyen uno de los materiales de elección cuando se trata de identificar cadáveres en avanzado estado de descomposición. Presentan las ventajas de su sencillo modo de obtención y almacenamiento, además de altos niveles de eficiencia: más del 80 % con purificación previa; y la limitación de su degradación en algunos casos, según el estado de conservación del cadáver.

Como en todos los casos estudiados en el presente trabajo, la purificación del ADN aislado resulta clave para una mayor eficiencia.

5.4 RESTOS HUMANOS.

Estudio comparativo de métodos de extracción de ADN:

Se llevaron a cabo análisis de material cadavérico en diferentes condiciones de conservación, proveniente de individuos de diferente edad y sexo, con dos métodos de extracción: el que emplea proteinasa K / SDS; y el desarrollado en este Servicio, que utiliza el detergente CTAB.

TABLA XIV

Los resultados obtenidos muestran que el método que emplea CTAB resulta altamente satisfactorio para el procesamiento tanto de tejidos blandos parcialmente degradados como para huesos, a diferencia de la proteinasa K, que generalmente no permite obtener ADN analizable en las condiciones extremas mencionadas.

La explicación para tales diferencias puede ser que un tratamiento drástico del material (con una proteasa + un detergente) destruye completamente las células, solubilizando impurezas que coprecipitan con el ADN, lo cual se evita parcialmente con un procedimiento más suave como el que utiliza CTAB.

Cuando la muestra está constituída por tejidos blandos, aún los altamente degradados, y a veces por huesos, fué factible lograr resultados mediante PCR, ya que estas secuencias son de bajo peso molecular y por ello resisten los procesos degradativos. Esta circunstancia permitió poner de manifiesto la superioridad del método del CTAB, ya que algunos casos sólo arrojan resultado positivo mediante su utilización.

En cambio, las secuencias evaluables mediante transferencia a soportes sólidos (Southern blot), presentan tamaños de diez a cien veces superiores que las analizables mediante PCR, lo que las hace más fácilmente degradables y sólo pueden analizarse a partir de materiales en mejor estado de conservación.

Por último, debe considerarse que este experimento fué llevado a cabo únicamente a los fines comparativos entre dos métodos de extracción, por lo cual no se emplearon sistemas de purificación que hubieran aumentado la eficiencia.

 Determinación de la eficiencia del análisis en material cadavérico.

Se efectuó el análisis de muestras provenientes de cadáveres de individuos de diferente edad y sexo, en variadas condiciones de conservación:

Los resultados obtenidos se resumen en la tabla XV, indicándose el porcentaje de eficiencia del análisis efectuado. Se promediaron los valores obtenidos para las muestras en similares condiciones de conservación.

TABLA XV

Referencias: B: presencia de tejidos blandos; H: reducción completa (material óseo únicamente); Q: quemados; S: saponificado; M: momificado.

Los resultados tabulados en la Tabla XV son gráficamente representados en la Figuras 4 y 5, en cuanto a la relación con el grado de eficiencia diagnóstica y la forma de conservación del cadáver (Figura 4) y el grado de eficiencia diagnóstica y la edad al tiempo de muerte y tipos de tejidos empleados (Figura 5).

FIG. 4

FIG. 5

Los resultados obtenidos muestran que el aislamiento de ADN de alto peso molecular, condición requerida para un análisis completo, es ampliamente dependiente del estado de conservación de la muestra. Así, en cadáveres recientes es posible seleccionar porciones de tejidos que aún no han sido atacados por bacterias, con gran rendimiento cuali y cuantitativo en cuanto a la obtención de ADN.

En exhumados, adquiere importancia el ámbito en el que estuvo el cadáver: por ejemplo, un clima seco presenta reducida actividad bacteriana y favorece los fenómenos de desecación sin putrefacción, situación que conserva el ADN; mientras que un suelo húmedo produce el efecto contrario. En los inhumados en nicho, se presenta una situación similar al clima seco.

Resulta también importante la edad del individuo al momento de la muerte: un feto o un bebé presentan una estructura tisular más fácilmente atacable por bacterias que un adulto. Esta situación se refleja en porcentajes de eficiencia de análisis crecientes a medida que aumenta la edad del individuo al momento del fallecimiento.

Además, los cadáveres que aún presentan tejidos blandos permiten un estudio más amplio que los reducidos completamente (sólo material óseo), lo cual podría explicarse teniendo en cuenta que la existencia de material fácilmente atacable es un índice de un mejor estado de conservación y, por lo tanto, de ADN menos degradado.

La presencia de tejido blando parece ser decisiva en el análisis de cadáveres de fetos o bebés. Sus huesos y núcleos de osificación son más lábiles al ataque bacteriano, dificultando la obtención de ADN analizable en exhumados completamente reducidos.

En los individuos adultos, en cambio, los huesos y dientes son más adecuados como reservorio de ADN de alto peso molecular, pudiendo emplearse en el estudio son una eficiencia considerable.

Resulta conveniente seleccionar el tejido a extraer para análisis "in situ", de acuerdo a su aspecto: a veces es apropiada una fracción de piel, otras de músculo, huesos, etc.. Como regla general, podría decirse que se prefieren los tejidos que presentan menor alteración aparente.

La presencia de elementos que se agregan con el objeto de conservar la estructura del tejido (ej.: formol) es decididamente nociva para el ADN ya que se combinan químicamente con él dificultando o impidiendo el análisis. El grado de deterioro del ácido nucleico dependerá de la cantidad de formol empleada y del tiempo de exposición al mismo, por lo que es conveniente intentar el análisis, ya que algunos sistemas pueden arrojar resultado positivo.

Los individuos saponificados o momificados pueden ser analizados, aunque sea parcialmente, varios años después, ya que su condición limita el ataque bacteriano. Del mismo modo, la alta eficiencia observada en cadáveres quemados puede explicarse en la "esterilización" que produce el fuego al momento del fallecimiento. Por supuesto, las muestras de elección son las zonas no carbonizadas ni calcinadas.

Determinación de la utilidad de los sistemas de locus múltiple en el análisis de material cadavérico.

Se empleó ADN de una muestra de material cadavérico consistente en "dedos del pie" de un individuo adulto, que había sido quemado. El ADN se cortó con las enzimas de restricción Hae III y Hinf I, transfirió y sondeó con una secuencia del fago M13. Se procesó simultáneamente ADN de tres hermanas de la víctima a modo de control.

Los resultados obtenidos, muestran que es útil para el establecimiento de vínculos biológicos entre individuos vivos, pero no para material cadavérico, en el que el ADN se encuentra parcialmente degradado. A esta circunstancia puede atribuírse la imposibilidad de observar bandas analizables en el camino correspondiente al fallecido.

Análisis de muestras provenientes de desastres en masa.

Atentado a la Embajada de Israel

El 17 de marzo de 1992, una gran explosión destruyó el edificio de la Embajada de Israel en Buenos Aires, provocando la muerte de más de veinte personas. Se remitieron a este Laboratorio diez muestras cadavéricas, quemadas y en estados variables de descomposición, a efectos de tipificarlas e intentar su identificación comparándolas con parientes biológicos vivos.

La estrategia de análisis empleada incluyó el estudio de minisatélites mediante sistemas de transferencia, HLA-DQa, determinación de sexo (SRY) y microsatélites polimórficos.

Ref.: ND: no se observan bandas o resultado no evaluable.

SRY: +: presencia del gen (individuo masculino); -: no detección del gen, por ausencia (individuo femenino) ó por razones técnicas (ej.: ADN altamente degradado).

Estos análisis, efectuados en el año 1992, son probablemente los primeros a nivel mundial en que se aplican los novedosos (para la época) sistemas de STRs, a la tipificación de restos humanos provenientes de desastres en masa. Se analizaron fragmentos de tejido blando, con una eficiencia relativamente alta (56 %) considerando el escaso desarrollo alcanzado hasta ese momento en los métodos de extracción y purificación de ADN.

Se observa una situación llamativa en la muestra 2: la presencia de más de dos bandas cuando se trata con una sonda de locus único. La explicación a este fenómeno no puede hallarse en la contaminación, ya que los restantes sistemas analizados para el mismo material no muestran resultados anormales. Se desconoce si la presencia de niveles elevados de radiación podría estar relacionada con estas observaciones.

En cuanto a la eficiencia de cada sistema, los porcentajes varían entre el 40 y el 70 %, pero el escaso número de muestras analizadas no permite obtener conclusiones al respecto.

 Atentado a la AMIA

El 18 de julio de 1994, una explosión destruye completamente la sede de la Mutual Israelita AMIA, provocando la muerte de alrededor de 100 personas. En este Laboratorio se recibieron más de 70 muestras de material cadavérico, con el objeto de determinar el número de víctimas y su identificación.

El parentesco entre los fallecidos y sus supuestos familiares biológicos fue evaluado, en un principio, por comparación con siete sistemas de microsatélites, y confirmado finalmente mediante transferencia e hibridización con sondas de locus específico.

Los resultados obtenidos del análisis de marcadores ubicados en cromosomas autosómicos de las muestras emergentes del atentado a la AMIA (analizadas mediante cinco sistemas de microsatélites) se resumen en la Tabla XVI.

TABLA XVI